一种新的微卫星PAGE的DNA显带方法

刘梦培，田 敏，傅大立，傅建敏，王彩霞

（1.中国林科院经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2.中国林科院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400）

微卫星DNA又称简单序列重复（simple sequence repeats，SSR)，是由1～6个碱基多次串联重复组成的核苷酸序列，在基因组间广泛分布，具有共显性、重复性好、多态性高、扩增结果稳定、检测手段简便易行等优点[1]，已成功应用在物种的遗传多样性（genetic diversity）[2－3]、遗传图谱构建（genetic mapping）[4－5]、系谱分析（Pedigree analysis）[6－7]、遗传育种（Genetics and Breeding）[8－9]等方面。

微卫星DNA条带的鉴别常采用聚丙烯酰胺凝 胶 电 泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）银染法，PAGE由Raymends和Weintraub在1959年创建，具有不易扩散、灵敏度高、分辨率高等优点[10]。银染技术是其常用的显影方法，如Bassam银染法[11]、Sanguinetti银染法以及在其基础上改良的一系列银染法。银染法的缺陷是步骤繁琐、耗时长、背景模糊、条带不清等，极易造成DNA条带错判，从而产生分析误差。许多研究者针对这些问题做了大量研究，但不能从根本上解决问题。本研究提出了微卫星PAGE的荧光染料显影法，试图从一个新的思路解决PAGE显带的问题。

1 材料和方法

1.1 材料

杏属不同品种幼嫩叶片；SSR引物UDP98-405，正向引物序列：5′-ACGTGATGAACTGACACCCA-3′，反向引物序列：5′-CCTACCGTCTCGTTTCT GAG-3′；GelRed核酸荧光染料。

1.2 PCR反应体系和程序

PCR反应体系总体积20μL，其中10×PCR Buffer 2.0μL、25 mmol/L MgCl21.2μL、10 mmol/L dNTPs MiX 0.4μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.3 μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL、DNA模板0.5μL、ddH2O 14.6μL。PCR反 应 在Bio-Rad C1000T M Thermal Cycler型号的扩增仪上进行。ISSR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸90 s，35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。试验于中国林科院亚热带林业研究所植物细胞工程实验室内完成。

1.3 琼脂糖凝胶电泳显带

PCR产物在浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上分离；核酸荧光染料为GelRed，采用前染的方法，将GelRed核酸荧光染料加到溴酚蓝上样缓冲液中。将4μL PCR产物与2μL含有gelred的溴酚蓝上样缓冲液在PCR管中混合均匀，取3μL上样，80 V电压下电泳1.5 h。

电泳结束后，将凝胶直接放入上海产FR-200A型全自动紫外与可见分析装置中进行拍照和分析。

1.4 改良的微卫星PAGE凝胶银染法显带

PCR产物在8%（29∶1）聚丙烯酰胺凝胶上分离，胶片大小为195 mm×120 mm×1 mm（长×宽×高），将8μLPCR产物与2μL溴酚蓝上样缓冲液在PCR管中混合均匀，取3μL上样，120 V电压下电泳3 h。

电泳结束后，用自来水冲洗玻璃板双面，预冷；剥下凝胶，固定液（0.5%冰醋酸、10%无水乙醇）中固定20 min；用ddH2O洗涤2次，银染液（0.15%硝酸银）中渗透15 min；再用ddH2O洗涤2次，显影液(1.5%氢氧化钠、1%甲醛)中显影10～15 min，直至出现清晰的DNA条带为止；显影后立刻用ddH2O洗涤1次，将凝胶放入全自动紫外与可见分析装置中进行拍照和分析。

1.5 PAGE凝胶荧光染料显影法显带

PCR产物在8%（29∶1）聚丙烯酰胺凝胶上分离，凝胶规格同1.4；核酸荧光染料为GelRed，采用前染方法，同1.3。将8μL PCR产物与2μL含有gelred的溴酚蓝上样缓冲液在PCR管中混合均匀，取3μL上样，120 V电压下电泳3 h。

电泳结束后，用自来水冲洗玻璃板双面，预冷；剥下凝胶，清水冲洗后，直接放入全自动紫外与可见分析装置中进行拍照和分析。

2 结果与分析

2.1 琼脂糖凝胶电泳法

琼脂糖凝胶电泳检测杏属植物品种DNA的效果见图1，图片中的1～66分别代表杏属的66个品种。从图1中可以看出，杏属66个品种的琼脂糖凝胶电泳目的条带清晰明亮，大小在100 bp左右，无非特异性扩增条带。但由于琼脂糖凝胶电泳分辨率低，只能区分约相差100 bp的DNA片段，故杏属琼脂糖凝胶电泳的结果为一条清晰的目的条带，无法判定品种间差异。

2.2 改良的微卫星PAGE银染法

图1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

改良的微卫星PAGE银染法检测杏属植物品种DNA的效果见图2。从图2可以看出，杏属PAGE银染图片的背景、分辨率、目的条带相对清晰，从指纹图谱可以有效进行品种间差异鉴定。但由于银染步骤繁琐，固定、银染、显影时间难以掌握，部分物种出现了染色深、背景模糊的现象，如品种1、5、42、53、54的指纹图谱。此外，部分品种还容易出现主带跟非特异性条带区分不明显的现象，如品种29、33、46、51、56、57的指纹图谱。

图2 改良银染方法显影结果

2.3 PAGE凝胶荧光染料显影法

PAGE凝胶荧光染料对杏属植物品种DNA显色，效果非常理想，见图3。从图3可以看出，杏属66个品种PAGE凝胶荧光染料显影显色的条带与PAGE银染结果完全一致，甚至那些微弱的非特异性条带同银染结果也完全一致。与PAGE银染相比，PAGE荧光染料显影的效果更好，表现为图片背景更清晰、分辨率更高、目的条带更清晰、主带与非特异性条带区分更加明显等。由于PAGE凝胶荧光染料显色法简单易行，不会出现因时间控制不好导致染色过深或染色失败的现象，因此，该方法具有更多优越性。

图3 凝胶荧光染料法显影结果

3 讨论与结论

常用的DNA显带技术有Southern杂交、琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳[13]。Southern杂交因使用放射性同位素而具有放射性污染，故很少被人使用。琼脂糖凝胶电泳可快速分别、纯化和判定DNA，但其分辨率低，无法区分微卫星DNA条带，这一点在杏属实验结果中也得到了证实。聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率高（理论上可以分开长度相差0.1%的DNA分子），在显色上以银染技术代替同位素放射技术而独占优势，故在微卫星分子标记分析方面应用广泛。但PAGE银染技术有步骤繁琐、耗时长、显色时间不易控制、背景模糊等缺陷，一般而言，普通的银染技术需要2～3 h，本实验采用改良的银染技术也需要30～60 min。作者提出的PAGE荧光染料显带法既具有琼脂糖凝胶电泳的快速分别、纯化和判定DNA等优点，又具有PAGE银染分辨率高的优点，而且还简单易行，快速高效，是一种值得推广的显带技术。

近些年，关于银染技术的改良，人们进行了大量的研究，关海涛等[14]比较了Bassam和银染法Sanguinett银染法的显影效果；梁宏伟等[15]对缩短银染时间进行了研究；杜爽等[15]对聚丙烯酰胺凝胶的种类、浓度及其银染方法进行了优化；许丽等[16]对银染温度和显色温度进行了研究。PAGE银染的原理是利用银离子和核苷酸结合，在碱性环境下甲醛能使阴离子还原从而使凝胶中的DNA得以显现，故PAGE银染的步骤繁琐、背景不清晰、甲醛危害等问题无法从根本上得到解决。在银染操作过程中，银染后漂洗过度可能造成DNA带不清晰或无带的现象；AgNO3浓度高、银染时间长、银染后漂洗时间短、显色时间长都有可能造成凝胶背景发黄、颜色过深等现象；另外，摇晃不均匀还可能造成显影不均匀等现象。这些都是银染技术很难避免的缺陷。

琼脂糖电泳能快速分离、纯化和判定DNA，优势在于核酸荧光染料的利用，如EB、SYBR系列染料、UltraPower核酸染料、GelRed和GelGreen等，原理是荧光染料以非共价键的方式与DNA/RNA结合，在紫外线的照射下发出明亮的橙色荧光，实现DNA条带显示。利用相同的原理，在PAGE凝胶中使用核酸荧光染料，同样可达到高分辨率、快速判定DNA的目的，而这一方法至今没人采用。张玉魁等[17]认为EB毒性大，PAGE会淬灭EB的荧光，使EB检测的灵敏度降低。本实验使用的是无毒的荧光染料GelRed，研究发现聚丙烯酰胺对GelRed荧光并没有产生淬灭作用，没有降低GelRed的灵敏性。实验结果表明，由于PAGE核酸荧光染料显影法省去了银染法琐碎的步骤，因而简单易行。

PAGE银染、显影的胶片质量对统计分析至关重要，若胶片背景色浓、分辨率低、条带模糊，则在统计时很容易误判，导致分析结果不准确，甚至完全错误[18]。微卫星PAGE荧光染料显影法，显影图片的背景、分辨率、目的条带都更加清晰可靠，可以在微卫星PAGE凝胶电泳上的显带分析上应用。

PAGE银染容易伴随出现一些显色较浅的非特异性条带，Murray等[19]认为这是由于DNA复制过程中的滑动错配造成的。有时非特异性带不能完全消除，但是它不会影响等位基因的判定，因为在某特定的位点上，非特异性带的带型通常是固定的，并且显影后主带比非特异性带清晰、易读[20]。微卫星PAGE荧光染料显影法下，主带跟非特异性条带的区分比银染法更加明显。总之，微卫星PAGE荧光染料显影法是一种成功的微卫星PAGE显影方法。

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