纤维素分解菌的筛选及其紫外诱变

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(东南大学化学化工学院,江苏 南京 210009)

纤维素是植物细胞壁的主要成分，约占植物干重的30%～50%，是自然界中分布最广的天然高分子化合物，也是地球上数量最丰富、最廉价的可再生资源[1,2]。自然界中广泛存在产纤维素酶的微生物，包括细菌、真菌、放线菌等。微生物产生的纤维素酶已经用于纤维素类生物质生产葡萄糖、饲料工业、纺织行业、环境保护、农产品加工等方面[3]。直接从环境中选育出来的野生型菌株产纤维素酶活性不高，菌种易退化，限制了其应用范围。因此，选育高产纤维素酶活性的微生物类群是人们研究的热点之一。作者从朽木、腐烂的竹叶和稻草中分离得到8株纤维素分解菌，并对其中酶活较高的菌株进行了紫外线诱变。

1 实验

1.1 材料与试剂

朽木、腐烂的竹叶与稻草从自然界中采集。

DNS试剂，pH值7.2的缓冲溶液，1%羧甲基纤维素钠(CMCNa)磷酸缓冲溶液。

1.2 培养基

霉菌斜面培养基:马铃薯200 g, 蔗糖20 g, 琼脂17 g, 蒸馏水1000 mL, pH值自然。

羧甲基纤维素钠培养基:(NH4)2SO42 g, MgSO40.5 g, KH2PO41 g, NaCl 0.5 g, 羧甲基纤维素钠10 g, 琼脂17 g, 蒸馏水1000 mL, pH值自然。

产酶液体培养基: 麦草粉40 g, 麦麸10 g,(NH4)2SO41.5 g, KH2PO41.0 g, MgSO40.5 g, NaCl 0.2 g, CaCl20.2 g, 蒸馏水1000 mL。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分离与初筛

朽木、腐烂的竹叶与稻草等分别放入锥形瓶中，加入适量的灭菌生理盐水，振荡30 min，静置，各吸取上清液1 mL，分别稀释10、102、103倍，涂布在羧甲基纤维素钠培养基上，30℃培养7 d，挑取大的单菌落进行划线分离。将分离得到的菌株接种于新的羧甲基纤维素钠培养基上培养3 d，用刚果红染色法[3]测定菌落直径及透明圈直径，对其中8株产酶活性较高的菌株进行酶活性测定，从中筛选出产酶活性最高的菌株。

1.3.2 2#菌株孢子悬液制备

将初筛得到的2#菌株接种到霉菌斜面培养基上活化3 d，用无菌生理盐水洗下孢子，打散后用血球计数板计数，稀释孢子液浓度至1×106～1×108个·mL-1，得孢子悬液。

1.3.3 紫外线诱变处理

打开紫外灯将无菌操作箱灭菌20 min。取 8 个直径9 cm培养皿，每皿中加入5 mL孢子悬液，在20 W紫外灯下30 cm处分别照射0 s、6 s、12 s、18 s、24 s、30 s、40 s、50 s，将经过照射的孢子悬液适当稀释后涂布于羧甲基纤维素钠平板上，黑布包好后置于30℃恒温培养箱中培养3 d。菌落计数，绘制存活曲线。

1.3.4 突变株的筛选

选择致死率为60%～90%的紫外线剂量诱变。将诱变后的孢子悬液适当稀释后涂布于羧甲基纤维素钠平板上，按初筛方法筛选出产酶活性较高的突变株。将其接入产酶液体培养基中30℃培养3 d。用DNS比色法测定酶活性，进一步筛选出产酶活性较高的突变株，接种于斜面上，置于冷藏室保存。

1.3.5 纤维素分解菌的酶活性测定[4，5]

将菌株接种于产酶液体培养基中摇床培养3 d，培养液在3500 r·min-1离心10 min，上清液即为初酶液。移取含有1% CMCNa的磷酸缓冲溶液1.5 mL于试管中，加人初酶液0.5 mL，于50℃水浴中保温20 min后，按DNS法测糖含量。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线

采用DNS法[4]，在波长为530 nm条件下，测定一系列已知浓度葡萄糖的OD值，绘制葡萄糖标准曲线，结果见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 菌株的初筛

涂布了样品水溶液的羧甲基纤维素钠培养基培养7 d后，培养基上长出很多大小不同的菌株，菌株颜色有乳白色、浅绿色、墨绿色、灰白色、黑色等。观察菌株形态，大部分为霉菌。用刚果红染色法选取8株透明圈直径(D2)和菌落直径(D1)的比值相对较大的菌株，结果见表1。

表1 8株菌株的透明圈直径和菌落直径

测定上述8株菌株的酶活性，结果见表2。

表2 8株菌株酶活性测定结果

从表2可以看出，2#、6#和8#菌的OD值及产酶活性较高，尤其是2#，这与刚果红染色法结果一致。但对于3#、4#、7#菌，刚果红染色法与OD法测定的酶活性大小不同。所以仅以D2/D1值作为菌株产纤维素酶活性大小的唯一定量指标不可靠。因为不同菌种、生长条件、纤维素酶系、产酶速度、菌苔大小及在平板上堆积情况的差异都可能造成D2/D1值与产酶活性结果的不完全一致[6]。综合两种方法结果，选择2#菌株进行紫外线诱变。

2.3 2#菌株紫外诱变存活率曲线(图2)

图2 存活率与紫外线照射时间的关系

从图2可以看出，在0～50 s照射时间内，随着紫外线照射时间的延长，2#菌存活率迅速下降。照射时间为5 s、6 s、12 s、19 s时其致死率分别为60%、70%、80%、90%。

2.4 突变株的筛选

以致死率60%～90%的紫外线剂量诱变2#菌株，得到了一系列突变株，结果见表3。

表3 致死率为60%～90%的突变株筛选情况

从表3可以看出，致死率为80%的M10菌株在所有突变株中产酶活性最大，其产酶活性相对于出发菌株提高了89.1%。

3 结论

(1)利用羧甲基纤维素钠为唯一碳源培养基从朽木、腐烂的竹叶与稻草中分离得到8株纤维素分解菌，测定了其产酶活性。对其中产酶活性较高的2#菌株进行紫外线诱变，进一步筛选得到突变株M10，相对酶活较出发菌株提高了89.1%。

(2)实验中发现，以水解圈直径/菌落直径比值判断菌株产纤维素酶活性大小并不可靠，需要进一步测定酶活。

参考文献：

[1] Munisiwaran P K A，Charyulu N C L N. Solid substrate fermentation of coconut coir pith for cellulase production[J].Enzyme Microb Technol，1994，16(5)：436-440.

[2] Peter M，Zarnea G,Adrian P，et al. Biodegradation and bioconversion of cellulose wastes using bacterial and fungal cells immobilized in radiopolymerized hydrogels[J].Resources，Conservation and Recyling，1999，27(5)：309-332.

[3] 刘春芬，贺稚非，蒲海燕，等.纤维素酶及应用现状[J].粮食与油脂，2004，(1)：15-1.

[4] 魏亚琴，李永泉，李红玉.分解纤维素的三株真菌的筛选与鉴定[J].兰州大学学报，2008，44(S1)：92-96.

[5] 傅力.纤维素酶测定方法的研究[J].新疆农业大学学报，2000，25(2)：45-48.

[6] 房兴堂.秸秆纤维素分解菌的酶活力测定[J].生物技术通讯，2007，18(4)：628-630.