人牙周韧带细胞在SGBG/PHBV三维支架材料上分泌功能的研究

陈建洪 黄南楠 唐倩 吴坚

牙周组织在牙周病变过程中因炎症而被破坏，如何获得牙周组织结构和功能的重建-即牙周组织的再生，是牙周病研究领域的重要课题。牙周组织缺损的修复主要针对牙周韧带、牙骨质和牙槽骨的修复。应用组织工程修复牙周组织缺损为牙周病的治疗开辟了一条新途径。

本实验中，我们选用第四代的人牙周韧带细胞作为种子细胞，溶胶-凝胶生物活性玻璃(sol-gel bioglass，SGBG)/聚羟基烷酸酯(poly-3-hydroxy butyrate-co-3-hydroxy valerate，PHBV)作为支架材料，通过细胞支架体外复合培养的直接接触实验，检测材料对人牙周韧带细胞分泌功能的影响，为牙周组织工程支架材料的选择提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源 SGBG/PHBV(华南理工大学材料学院提供)。

1.1.2 主要仪器和试剂 全自动CO2培养箱(Forma，USA)，医用超净工作台(苏州净化仪器厂)，倒置相差显微镜(Nikon，Japan)，纯水系统(Millipore，USA)，高速离心机(飞鸽，中国)，高糖 DMEM 培养液(Gbico，USA)，胎牛血清(PAA，美国)，胰蛋白酶(Sigma，USA)，MTT 3-(4，5-2 甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(Sigma，USA)，抗波形丝蛋白单克隆抗体(博士德，中国)，抗细胞角蛋白单克隆抗体(博士德，中国)，倒置相差显微镜及照相系统(Nikon，Japan)，扫描电镜(PHILIPS XL-30，Holand)，羟脯氨酸试剂盒(南京建成，中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 PDLCs体外培养［1］取因正畸拨除的第一或第二前磨牙，用组织块培养法进行原代培养。培养液为含10%FBS的DMEM完全培养基，于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养。最早第7天，可见组织块边缘游出细胞。待细胞长满瓶底约80%时进行首次传代，4～8代细胞用于实验。

1.2.2 细胞来源鉴定 利用免疫组化ABC法进行波形丝蛋白单克隆抗体和细胞角蛋白单克隆抗体染色。

1.2.3 直接接触法观察材料形态和功能

1.2.3.1 支架材料准备 SGBG/PHBV块状多孔支架材料，将块状多孔SGBG/PHBV制成5mm×5mm×3mm的方形小块，过氧化氢等离子低温灭菌系统消毒，置24孔板内用不含FBS的DMEM预湿过夜后接种细胞。

1.2.3.2 PDLCs与SGBG/PHBV复合培养 用0.25%胰蛋白酶消化状态良好的细胞，1000 rpm×5 min离心，将细胞浓度调整至 1 ×106/ml，接种于材料上，每块接种 200 μl，置37℃培养箱中，4 h后补加培养液1～2 ml，以后隔天换液。

1.2.3.3 细胞功能的检测 制备细胞悬液，对照组共设27孔，细胞计数后直接接种于两块24孔板，5×104个细胞/孔。实验组三维培养接种方法和密度同前，取27块材料分别培养于两块24孔板的27个孔内。分别在三维培养后12 h，24 h，48 h，各孔吸出细胞上清液1 ml，无菌封存，4℃保存。将共组共54份细胞上清液，按羟脯氨酸试剂盒说明书操作，用分光光度计在550 nm，空白管调零，测各管吸光度。

上清液中羟脯氨酸含量(μg/ml)=测定管吸光度/标准管吸光度×标准管浓度(2 μg/ml)。

换算成相同细胞数的羟脯氨酸含量运用SPAA12.11软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 细胞培养及来源鉴定 PDLCs传代后，细胞大多呈长梭形，少量呈多角形，胞体丰满，伸展良好，胞浆均匀，核圆，核仁清晰，细胞排列均匀，密集时呈漩涡状，火焰状。免疫组化ABC法进行波形丝蛋白单克隆抗体和细胞角蛋白单克隆抗体染色，细胞呈波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性，提示细胞来源为外胚间充质。

2.2 化学比色法测定细胞分泌功能

表1 上清液羟脯氨酸量(μg/ml)测定值统计分析表()

表1 上清液羟脯氨酸量(μg/ml)测定值统计分析表()

n对照组 实验组P 12 h 9 0.4829±0.0330 0.5586±0.0640 0.00024 h 9 0.5172±0.0594 0.5880±0.0153 0.01748 h 9 0.5441±0.0470 0.6003±0.0206 0.019

表中可看到，同一时间点内对照组与实验组间行配对t检验，相同的时间点内，实验组的上清液羟脯氨酸量，均值均大于对照组。三组配对t检验，均为P＜0.05，有统计学差异。表示相同时间和细胞数的条件下，实验组的细胞，分泌更多的胶原，提示细胞种植在支架材料上的三维培养，更能促进细胞的分泌功能。

3 讨论

牙周韧带细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是构成牙周组织的主要细胞，在牙周组织修复过程中，PDLCs起了关键性的作用。但在牙周病损部位，PDLCs来源非常有限，以至于牙周组织很难达到有效的再生和重建，而组织工程技术有望解决这一难题。

生物活性玻璃作为一种新型的硬组织修复材料，具有理想的生物活性及骨重建功能。生物活性玻璃支架植入机体后最显著的变化是富含非晶型磷酸钙表层的形成，可选择性地吸收血清蛋白，有利于细胞吸附的成骨细胞的表型表达［2］。聚羟基烷酸酯(PHBV)是由细菌发酵产生的热塑性生物聚酯，具有良好的组织相容性，作为骨移植组分，具有增强作用，一定时间内可完全生物降解［3］。将二者进行复合，制成三维立体多孔材料，既能发挥PHBV的局部正性压电效应，刺激骨细胞的生长分化，又能发挥SGBG的骨传导作用和材料三维多孔结构的骨诱导作用。研究结果表明［4］，羟基磷灰石多晶体可吸附粘多糖胶样层、粘多糖、糖蛋白，从而在SGBG和骨之间形成有机-无机界面，这种结合非常稳定，有利于新骨在BG表面的形成和生长。PHBV分子链的水解产物的排出及BG表面羟基磷灰石多晶体的形成，对于骨组织在多孔支架上形成、生长和正常的新陈代谢是非常有利的。

进行牙周组织工程研究，首要任务之一是选择符合牙周组织工程的支架材料。传统的生物活性玻璃［5，6］，由于是在1400℃左右熔化后经一系列后续加工而成，制备工艺复杂，性能不够稳定。本研究所用的生物活性玻璃，是利用溶胶-凝胶法低温制备的纳米尺寸的SGBG/PHBV，具有很好的生物相容性。生物活性玻璃，应用于单纯骨组织修复的研究较多，但在牙周组织修复的研究较少。本实验所用SGBG/PHBV，国内未见运用于牙周组织工程的研究报道。

细胞培养法是评价生物材料组织相容性的重要方法，与体内实验相比具有简便、重复性好实验条件易于控制等优点。本实验采用直接接触法，通过将体外培养的PDLCs接种到SGBG/PHBV三维支架上复合立体培养，使SGBG/PHBV与牙周组织的主要功能细胞PDLCs直接接触，检测材料对细胞分泌功能的影响，为SGBG/PHBV构建牙周组织工程支架的可能性提供初步的研究数据。将高密度细胞接种在具有一定空间结构，有一定孔隙率，孔径大小，孔间交通的支架材料上，细胞在模拟体内细胞的化学，物理和生物学条件下，在三维基质支架中进行培养称为三维培养［7］。细胞在三维立体的空间结构中生长，能够更好地增殖和行使分泌功能。PDLCs的成纤维表型分泌III型胶原，成骨细胞表型分泌I型胶原。羟脯氨酸特定地存在胶原蛋白中，而不存在于一般的蛋白质中。测定上清液中羟脯氨酸含量，可以定量地反映细胞分泌的胶原含量，研究SGBG/PHBV对PDLCs分泌胶原功能的影响。结果表明材料对PDLCs的增殖和分泌胶原的功能不但均未见抑止作用，而且细胞三维培养更能促进细胞的分泌功能。表明SGBG/PHBV和PDLCs具有良好的生物相容性，SGBG/PHBV可进一步应用于牙周组织工程的研究。

［1］ZHANG MZ，LEI YY，LIU X，el al.Study of Primary Cultured Human Periodontal Ligament Fibroblasts.Academic Journal of Kunming Medical College，2004，(1):53-56.

［2］Oscar Peitl Filho，Guy P，Latorre，Larryl Hench.Effect of crystallization on apatite-layer fomation of bioactive glass 45S5.Biomed Mat Res，1996，30:509.

［3］ZHANG LL，DENG XM.Thermoplastic Polyester via Biosynthesis by Bacterial Fermentation-Poly(β-hydroxybutyrate).Polymer Bulletin，1994，1:1.

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［5］O.H.Andeersson.Calcium Phosphate Formation at the Surface of Bioactive glass in vitro.Biomed Mat Res，1991，25:1019.

［6］Oscar Peitl Filho，Guy P，Latorre，Larryl Hench.Effect of crystallization on apatite-layer formation of bioactive glass 45s5.Biomed Mat Res，1996，30:509.

［7］Matsuda N，Kumar NM，Ramakrishnan PR，et al.Evidence for upregulation epidermal growth-factor receptors on rat periodontal ligament fibroblastic cells associated with stabilization of phenotype in vitro.Arch Oral Boil，1993，38(7):559-569.