“泻剂结肠”大鼠胃肠道黏膜嗜铬细胞及 5-HT的变化

桂 林 刘云肖 徐德龙 赵淑明

(河北医科大学第三医院,河北 石家庄 050051)

“泻剂结肠”是由于长期服用泻剂而致肠道神经系统失调和相应功能紊乱,使结肠动力障碍,对泻剂反应性降低,从而导致病人对泻剂形成依赖性的一种状态。其主要特点是顽固性便秘,其病因、发病机制不明。本实验采用大黄浸液建立大鼠“泻剂结肠”模型,在不同时段观察大鼠胃肠道嗜铬细胞及 5-HT的变化,以深入探讨“泻剂结肠”致慢性传输型便秘(STC)的病因及发病机制。

1 材料与方法

1.1 药物 大黄粉购自乐仁堂药店,大黄粉加 15倍沸水,恒温浸泡 30min后过滤制成大黄浸液。

1.2 动物 健康成年 Wistar大鼠 72只,雌雄各半,体重(200±20)g,河北省动物实验中心提供(合格证编号:DK 0510071),随机分为实验组、对照组,每组 36只,两组体重、性别无差异。

1.3 试剂 TP、5-HT标准品购自 Sigma公司;总蛋白测定试剂购自首都医科大学临床医学科技中心;兔抗 5-HT抗血清原液、生物素标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素购自北京中山生物技术有限公司。

1.4 仪器 970型荧光分光光度计,上海精密仪器有限公司;MDF-382E型超低温保存箱,日本三洋公司;Humalyzer2000型半自动生化仪,德国豪迈公司。

1.5 方法 清洁级实验室适应性饲养 1 w后,实验组用大黄浸液灌胃 1次/d,首日剂量为 800 mg/kg(含生粉),此后每日剂量增加 200 mg/kg,直至实验组半数大鼠粪便变稀,保持剂量至80%大鼠稀便消失,继续加量给药,至半数大鼠粪便变稀,如此程序循环 3次;对照组以等体积蒸馏水灌胃。待实验组第 3次80%的稀便消失 1 w后,大鼠禁食 24 h,经口灌入 100 g/L活性炭悬液 2 ml,从活性炭灌胃完毕开始计时,记录从灌胃到首粒黑便排出的时间,证实实验组大鼠首粒黑便排出时间显著延长,肠道传输速度明显减慢,停止给药。建立模型时间 77 d,首次出现半数致泻大黄粉用量 1 600 mg/kg,最后一次调整剂量为4 600 mg/kg。

1.6 取材及检测指标 建立模型过程中,分别于第一次半数大鼠稀便时、第一次 80%大鼠的稀便消失时、第二次半数大鼠稀便时、第二次 80%大鼠的稀便消失时、第三次半数大鼠稀便时,随机选取实验组及对照组大鼠各 4只,乙醚麻醉,经腹正中切口,迅速切取胃窦、空肠(距幽门 15 cm)、回肠(距回盲瓣5 cm)、盲肠、横结肠、直肠(距肛缘 2 cm)组织块约 1 cm,生理盐水冲洗,多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片检测。泻剂结肠模型建成后,将所有剩余大鼠乙醚麻醉,股动脉取血 3 ml,检测 5-HT,开腹切取距幽门 5 cm的十二指肠、距肛缘 5 cm乙状结肠组织块,重约 200 mg,检测组织匀浆中 5-HT,同前顺序切取胃肠道 6块组织,多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片检测。

1.6.1 免疫组化染色观察肠嗜铬细胞变化 镜下观察免疫反应阳性细胞分布及形态,每张切片高倍镜(400×)下随机选取10个视野,进行免疫反应阳性细胞计数,统计平均值。

1.6.2 十二指肠、乙状结肠组织匀浆中 5-HT含量测定 十二指肠、乙状结肠组织块制成 20%匀浆,双缩脲法测定组织匀浆中的总蛋白(TP)。计算总蛋白含量 =测定×标准浓度/标准(g/L)。取组织匀浆 200μl,采用荧光分光光度法测定组织匀浆中 5-HT荧光强度,标准品浓度为 300μg/L,组织匀浆 5-HT含量 =测定 ×标准浓度/(标准 ×组织 TP含量)(μg/g)。

1.6.3 血清 5-HT含量测定 同上法,血清 5-HT含量 =测定 ×标准浓度 /标准(μg/L)。

1.7 统计分析 数据采用 x±s表示,采用 SPSS12.0统计软件进行成组 t检验。

2 结 果

2.1 血清、组织匀浆中 5-HT含量 实验组大鼠十二指肠、乙状结肠组织匀浆中 5-HT含量均明显高于对照组(P＜0.01);十二指肠组织匀浆 5-HT含量明显高于乙状结肠。两组大鼠血清中 5-HT含量比较,无显著性差异(P＞0.05);见表 1。

2.2 肠嗜铬细胞改变 两组大鼠胃肠道各段切片的黏膜层均可见 5-HT免疫反应阳性的肠嗜铬细胞,分布呈现胃窦密度最高,盲肠密度最低。第一次半数稀便时,实验组大鼠胃肠道各段肠嗜铬细胞密度明显低于对照组(P＜0.01或 P＜0.05),且胞质浅染,颗粒减少;在稀便消失时,实验组大鼠胃肠道各段肠嗜铬细胞密度增高,接近对照组(P＞0.05),并且染色加深,颗粒增多。第二次半数稀便、稀便消失及第三次半数稀便的切片中,仍可见上述变化,模型建立,肠传输速度明显减慢,实验组大鼠胃肠道各段肠嗜铬细胞密度高于对照组(胃窦、空肠、盲肠P＜0.01,回肠 P＜0.05)。见表 2。

表1 两组血清、组织匀浆中 5-HT含量的比较(x±s,n=36)

表2 两组大鼠各段肠道黏膜嗜铬细胞表达比较 (x±s,n=36)

3 讨 论

STC是因结肠传输功能减弱,致使肠内容物滞留而引起的顽固性便秘,部分患者可能是滥用泻剂所致。临床上难以取得足够的肠道全层标本,探讨其病因、病机。张连阳等〔1〕应用大黄,成功建立大鼠泻剂结肠模型,为我们研究泻剂对肠道的影响提供了有利工具。大黄性寒味苦,含有大黄酚、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚等蒽醌衍生物,其致泻效力与结合型蒽醌甙含量成正比,游离蒽醌衍生物无泻下作用。本实验参照有关文献〔2〕,对大黄粉采用温浸法处理,最大限度保留大黄粉的泻下作用,结果证明,泻剂结肠模型建立成功。

胃肠道黏膜无神经纤维分布,肠嗜铬细胞合成并储存机体的大部分 5-HT,其顶部突向肠腔,暴露于肠内容物中,有微绒毛增加表面积,起机械、化学换能器作用,受到刺激后,肠嗜铬细胞去极化,导致钙离子内流〔3〕,通过胞吐作用将 5-HT释放入腺腔和黏膜固有层。5-HT通过与相关受体结合,调控胃肠道感觉、分泌及运动功能。具体作用方式有以下 3种:①直接作用于黏膜上皮细胞或平滑肌产生分泌及运动;②作用于内源性传入神经(IPANs)及中间神经元,产生并调节分泌、蠕动反射;③作用于外源性传入神经突触后膜上的 5-HT3受体,将感觉信号传入中枢神经系统〔4,5〕,因此肠嗜铬细胞释放的 5-HT是胃肠道运动及分泌的始动因素。

传统观点认为泻剂大黄主要作用部位在大肠。本研究提示泻剂结肠的产生并不是由于肠嗜铬细胞破坏,数目减少,5-HT合成不足,而是长期应用大黄等泻剂,肠嗜铬细胞出现耐受,5-HT释放相对减少,不足以维持胃肠道正常运动及分泌所致,泻剂结肠大鼠十二指肠及乙状结肠组织匀浆中的 5-HT含量均高于对照组,也印证了上述观点。由于胃肠道肠嗜铬细胞主要向腺腔及黏膜固有层释放 5-HT,较少进入血液循环,因此两组大鼠血清 5-HT含量无明显差异。

总之,泻剂大黄导致STC,原于肠嗜铬细胞对泻剂刺激逐渐耐受,5-HT释放相对减少,引起胃肠道蠕动减慢、便秘;其作用影响整个胃肠道黏膜。

1 张连阳.一种大鼠“泻剂结肠”模型的建立〔J〕.大肠肛门病外科杂志,1998;3(1):66-8.

2 杨士友,黄世福,田 军.不同提取方法对大黄泻下成分的影响〔J〕.安徽医药,2004;9(2):90-2.

3 Racke K,Schworer H.Characterization of the role of calcium and sodium channels in the stimulus secretion coupling of 5-hydroxytryptamine release from porcine enterochromaffin cells〔J〕.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,1993;347:1-8.

4 Camilleri M,Mayer EA,Drossman DA,et al.Improvement in pain and bowel function in female irritable bowel patients with alosetron,a 5-HT3 receptor antagonist〔J〕.Aliment Pharmacol Ther,1999;13:1149-59.

5 Raybould HE,Glatzle J,Robin C,et al.Expression of 5-HT3 receptors by extrinsic duodenal afferents contribute to intestinal inhibition of gastric emptying〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2003;284:367-72.