银杏叶提取物对糖尿病大鼠脑组织的保护作用

杨旭芳 赵永光 杨云芳

(牡丹江医学院病理生理学教研室,黑龙江 牡丹江 157011)

糖尿病微血管病变所致的糖尿病脑病(diabetic encephalopathy,DE)主要表现为认知障碍,即记忆力减退、分析解决问题的能力与学习能力均下降。关于 DE的预防与治疗,还未找到可靠有效的药物,目前对心血管系统具有保护作用的传统中药银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,EGb)对DE的预防及其对脑组织的保护作用少有报道,故本研究应用链脲佐菌素(STZ)建立大鼠糖尿病(DM)模型,观察EGb对实验性DM大鼠血糖、血胰岛素、血浆内皮素(ET)及脑组织中 ET含量变化及治疗前后脑组织内 ET表达的影响,旨在探讨 EGb对 DM大鼠脑损伤的保护作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品 EGb购自北京双鹤天然药物有限公司,血糖试剂盒购自南京建成生物研究所。胰岛素、ET放免分析试剂盒购自中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所。STZ购自华美生物工程公司北京分公司。

1.2 动物及分组 选用 Wistar大鼠 40只,由本院动物室提供,雌雄各半,体重 200～250 g,大鼠禁食 16～18 h,自由饮水,随机取 30只经尾静脉注射 STZ(30 mg/kg),2 w后,做葡萄糖耐量实验(OGTT),筛选糖耐量异常者共 22只喂以高热量饮食,随机分为DM组和EGb,每组 11只。治疗组按 8 mg/kg剂量腹腔注射 EGb,1次/d;DM组大鼠每日腹腔注射同体积生理盐水;另 10只大鼠以普通饲料喂养,作为正常对照组,亦每日腹腔注射同体积生理盐水。三组均连续注射 8w。

1.3 血液样本的采集 大鼠空腹在乙醚麻醉下,内眦静脉取血约 6 ml,2 000 r/min离心 15 min,取分离血清贮存于 -20℃冰箱中,用于测定血清葡萄糖、胰岛素、ET。

1.4 脑组织匀浆的制备 取部分脑组织,用预冷生理盐水反复荡洗 3次,滤纸吸干,称重后置于玻璃匀浆器中,用冷冻处理的生理盐水将此标本制成 1∶10的组织匀浆,4 000～6 000 r/min离心 15 min,取上清液备用。

1.5 脑组织 ET mRNA表达的检测 把预留的脑组织快从-70℃冰箱中取出,取合适大小的组织快,放入预先用液氮预冷的研钵中研磨组织,加入 500μl Trizol,使其充分裂解,分别从三组中抽提总 RNA,RT-PCR检测 ET的表达。引物序列为ET:正义 5′-TTTTCCCTCCTCTTCTTCTGAT-3′;反义 5′-ACTTCTTGTCTTTTTGGTGAGC-3′;β-actin:正 义 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′;反 义 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。 并利用图像分析软件(IDImage Analysis Software)分析PCR产物/β-actin灰度比值。

1.6 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行分析,数据用x±s表示,组间差异的显著性用 t检验。

2 结 果

2.1 EGb对DM大鼠血糖的影响 实验 10 w时,DM组大鼠表现出糖耐量异常的变化(P＜0.05),1 h血糖增高显著(P＜0.01)达高峰,2 h血糖仍较高;正常对照组大鼠 30 min血糖达到峰值,2 h血糖基本恢复正常。10 w时治疗组则表现出糖耐量异常有明显改善。见表 1。

表1 实验 10w时血清葡萄糖水平(mmol/L,x±s)

2.2 血清胰岛素水平的改变 实验结束测定三组大鼠胰岛素水平,DM组高于对照组 〔(50.90±13.63)vs(34.11±5.82)μU/ml〕(P＜0.01),经 EGb治 疗后,胰岛素水平〔(40.96±6.41)μU/ml〕显著下降(P＜0.05),见表 2。

2.3 血浆及脑组织ET含量的测定 DM组大鼠血浆及脑中ET含量高于对照组(P＜0.01),经 EGb治疗后,血浆及脑中 ET含量则低于 DM组(P＜0.05)。见表 2。

表2 实验 10w时血浆与脑组织中 ET含量比较(x±s,pg/ml)

2.4 脑组织ET mRNA的表达 RT-PCR检测结果显示,三组均见 ET mRNA表达,正常组 ET/β-actin为 0.426±0.002,DM组为 2.402±0.001,治疗组为 1.102±0.001,治疗组 ET mRNA表达较 DM组明显下调。见图 1。

图1 RT-PCR检测ET mRNA的表达

3 讨 论

EGb是目前国内外药物治疗缺血性心脑血管病中的常用药物,其有效成分主要为银杏黄酮苷类和萜烯内酯类生物活性物质,具有清除氧自由基、抑制 NO的产生等作用〔1〕,还能舒张血管平滑肌、降低外周血流阻力、增加局部血流量、改善心脑等器官血液循环〔2,3〕。

DE是由于 DM糖代谢紊乱导致脑血管改变,损害中枢神经系统,使大脑在结构、神经生理及精神等方面发生病理改变,以获得性认知行为缺陷为特征的 DM慢性并发症〔4,5〕,有关DM脑神经细胞损伤的机制尚未明确,但一般认为与高血糖引起的代谢紊乱、氧自由基的作用以及血管内皮功能异常,促进ET的释放,最终导致血管舒张功能受损有关〔6〕。ET主要由内皮细胞产生,是血管内皮损伤的标记物,也是迄今发现的最强大、持续时间最长的血管收缩肽。

EGb具有显著的降糖、降低血浆胰岛素水平、清除氧自由基作用,本实验前期结果已阐述了EGb降糖、胰岛素、抗氧化应激的可能机制与其对胰岛的修复及清除自由基、抗脂质过氧化作用有关〔7〕,本次结果显示实验性 DM大鼠血浆及脑组织内ET的含量较对照组显著升高,这与戴自英等报道一致〔6〕。但经 EGb治疗后,ET水平明显下降,且脑组织内 ET mRNA水平表达下调,提示EGb降低ET的作用是通过抑制 ET基因表达实现的,具体的信号转导途径目前还不清楚,这将是下一步的研究目标,将为充分利用 EGb,开发一类用于预防和治疗 DM以及 DE的有效制剂提供依据。

1 La Casa C,Villegas L,Alarcon de la Lastra C,et al.Evidence for protective and antioxidant properties of rutin,a natural flavone,against ethanol induced gastric lesions〔J〕.JEthnopharmacol,2000;71(1-2):45-53.

2 Kubota Y,Tanaka N,Umegaki K,et al.Ginkgo biloba extract-induced relaxation of rat aortais associated with increase in endothelial intracellular calcium level〔J〕.Life Sci,2001;69(20):2327-36.

3 Nishida S,Satoh H.Comparative vasodilating actions among terpenoids and flavonoids contained in Ginkgo biloba extract〔J〕.Clin Chim Acta,2004;339(1-2):129-33.

4 田国庆,梁晓春.糖尿病性脑病〔J〕.中国康复理论与实践,2003;9(10):635-6.

5 Biessels Gj,van der Heide LP,Kamnal A,et al.Ageing and diabetes:implications for brain function〔J〕.Eur J Pharmacol,2002;441(1-2):1-14.

6 戴自英,陈灏珠.实用内科学〔M〕.第 11版 .北京:人民卫生出版社,2001:953.

7 邹 辉,杨旭芳,郭尚福 .银杏叶提取物对实验性 2型糖尿病大鼠心肌的保护作用〔J〕.牡丹江医学院学报,2007;28(6):9-11.