人参二醇组皂苷对人胶质瘤 U251细胞增殖与凋亡的影响

周丽琴

(北华大学附属医院神经内科,吉林 吉林 132013)

人参为五加科多年生草本植物,其成分具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用〔1〕。人参皂苷是人参中主要的有效成分,迄今已确定结构的至少在 30种以上,人参二醇组皂苷(PDS)即是其中一种,具有抗缺血再灌注损伤、清除氧自由基、抗氧化、阻滞钙通道等多种生物学效应〔2,3〕。本研究通过观察 PDS体外对 U251细胞增殖及凋亡的影响,探讨其抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 PDS由吉林大学药学院天然药物分析实验室提取;四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国 Sigma公司产品;激活的半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)9多克隆抗体购于Takara公司,顺铂为山东齐鲁制药厂生产。

1.2 细胞系及培养条件 人胶质瘤细胞株 U251(中科院上海细胞生物化学研究所提供)培养在含 10%胎牛血清的 RPMI1640培养液中,置 37℃、5%CO2湿化的培养箱中,待细胞长满 80%培养瓶时,分组加药。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 RPMI1640空白对照组(A组);2μmol/L顺铂组(阳性对照组,B组);PDS低剂量(50 mg/L)组(C组)、中剂量(100 mg/L)组(D组)、高剂量(200 mg/L)组(E组)。

1.3.2 细胞形态观察 取对数生长期细胞,调整细胞密度为1×105接种于 24孔板,1 ml/孔。培养过夜后换新鲜的培养液,按前述分组加药,48 h后倒置显微镜下观察细胞形态。

1.3.3 MTT比色法 在 96孔培养板,接种细胞 1×105/孔,每组 4孔,加药孵育 20 h及 44 h后每孔加 MTT(5 g/L)20μl,继续孵育 4 h吸弃培养液,每孔加入 DMSO 100μl,震荡 10 min,用酶标仪(波长 570 nm)测定各孔吸光度值(A),计算细胞生长抑制率,抑制率≥30%为细胞对该药敏感。抑制率 =(对照组A值 -给药组 A值)/对照组 A值 ×100%。

1.3.4 吖啶橙染色 将 10 mg吖啶橙溶于 100 ml、pH值为6.8的PBS中,过滤后 4℃避光保存。细胞爬片经不同药物处理后,加入 20μl吖啶橙储存液,荧光显微镜下观察,拍照。

1.3.5 流式细胞仪检测 传代培养的U251细胞接种于培养瓶中(1×106/瓶),次日加药处理,48 h后收集细胞,冷 PBS洗2次,-20℃、70%的冷乙醇固定,加入 115 ml PI(50 mg/L)染色。混匀后上流式细胞仪做单参数分析,用累积曲线分割法计算各期细胞比例。

1.3.6 免疫细胞化学染色 将大小适合的盖玻片放入 6孔培养板中,接种细胞为 5×105/孔,37℃、5%CO2中培养,次日加药,继续培养 48 h,PBS清洗,4%多聚甲醛固定,免疫细胞化学技术观察细胞内激活的caspase9表达情况。

1.4 统计学处理 数据处理采用SPSS9.0统计软件,数据以x±s表示,组间比较采用 χ2检验。

2 结 果

2.1 PDS对 U251细胞生长的影响

2.1.1 细胞形态观察 A组细胞贴壁能力强,细胞生长旺盛,形态完好。经PDS处理 48 h后,D、E组细胞形态均发生明显改变,即细胞呈现类圆形,周缘毛糙不规则,胞质中颗粒较多,贴壁能力下降,且出现悬浮细胞和细胞碎片,以E组较为突出,48 h后C组也可见少许死亡细胞出现。表明中,高剂量PDS体外可以抑制 U251细胞生长。见图 1。

2.1.2 不同药物对U251细胞增殖抑制作用 随着PDS浓度增加和作用时间的延长,细胞增殖抑制率逐渐增高,且呈明显时间、剂量依赖性。见表 1。

2.2 细胞凋亡检测

2.2.1 吖啶橙染色 A组细胞呈均匀绿色,形态规则,未见凋亡细胞;D、E组细胞出现不规则橘黄色荧光,细胞体积变小,胞核皱缩,呈现凋亡细胞的形态改变,且个别细胞胞膜破裂。见图2。

2.2.2 流式细胞术结果 与 A组相比,给药 48 h后,D、E组在 G1期前出现明显凋亡峰,呈现剂量依赖关系。见表 2。

2.2.3 细胞免疫化学结果 A组细胞 caspase9表达弱阳性,经 PDS处理的细胞casapae9表达明显上调,胞质中出现大量的棕黄色颗粒,随时间延长,剂量增加阳性细胞数增多,染色增强。见图 3。

表1 不同时间PDS对 U251细胞的增殖抑制率(%)

表2 给药48 h PDS对U251细胞周期及凋亡率的影响(%)

图1 不同药物处理U251细胞 48 h后形态学改变(×200)

图2 不同药物处理U251细胞 48 h后吖啶橙染色结果(×200)

3 讨 论

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,约占颅内肿瘤的 46%,占成年人全身肿瘤的 2%;恶性胶质瘤的发病率为(5～8)/100万,在 1998年WHO公布的按死亡率顺序排位中,恶性胶质瘤为 34岁以内患者的第 2位死亡原因,35～60岁患者的第 3位死亡原因〔4〕。胶质瘤浸润广泛,手术极难全切,具有高发病率,高致残率和高死亡率,目前临床治疗效果难以令人满意。目前尚缺乏有效的治疗手段。寻找新的治疗手段成为神经外科的研究热点之一。

本实验通过 MTT法观察细胞生长抑制情况,用吖啶橙染色和流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期改变。结果表明,PDS对人 U251细胞在体外有抑制作用,且随剂量的增长,作用时间延长,抑制作用增强。生长抑制试验中,当药物浓度为200mg/L时,抑制率达 37.26%,表明 U251细胞经 PDS处理后体外生长受到明显的抑制作用。

正常细胞周期中存在周期调节控制点,而癌细胞的细胞周期失去了周期控制点的调节,可以无限增殖。如果药物能恢复周期控制点的作用,使肿瘤细胞在任何一个环节出现障碍使其细胞不能得到增殖〔5〕。本实验流式细胞仪检查结果分析表明,200mg/L PDS可使细胞大部分阻滞于S期,延缓由 S期进入G2期,因此细胞增殖能力大大限制。近年来研究表明,许多抗癌药物均能诱导肿瘤细胞发生凋亡,这可能是这些药物抑制肿瘤生长的机理之一。

已知 caspase家族是细胞凋亡发生核调控的重要因素,caspase家族中又以 caspase-9为最重要的调节分子〔6〕。本研究通过免疫组化结果发现,空白对照组 U251细胞只有少量激活的 caspase-9蛋白表达,而 PDS可上调 caspase-9表达且呈现剂量依赖关系。表明 PDS可能激活了细胞内线粒体依赖途径的激活 caspase-8,然后作用于 Bid(Bcl-2 inhibitory BH 3-domaincontaining protein),形成有活性的tBid(truncated BID),tBid使线粒体释放 Cytochrome C,Cytochrome C再与 Apaf-1和 Procaspase-9形成复合体激活 caspase-9,激活了的 caspase-9再通过caspase-9、7,降解细胞骨架蛋白,使 U251细胞凋亡〔7,8〕,至于PDS诱导 U251凋亡的信号转导通路的具体机制尚需进一步探讨,PDS抗胶质瘤细胞增殖的特性有可能开发成为治疗胶质瘤的辅助药物。

1 国家药典委员会 .中药大辞典〔M〕.上海:上海科技出版社,2000:3-5.

2 王建春,孙晓霞,王 志,等 .人参二醇组皂苷对内毒素休克大鼠脑皮质 TLR4mRNA表达的影响〔J〕.中国病理生理学杂志,2005;21(12):2431-3.

3 李 峰,郭聪慧,李 扬,等 .人参二醇组皂苷对大鼠有丝分裂原反应性的影响〔J〕.免疫学杂志,2004;20(3):243-5.

4 Mischel PS,Cloughesy TF.Targeted molecular therapy of GBM〔J〕.Brain Pathol,2003;13(1):52-61.

5 Viola S,Consoli GM,Merlo S,et al.Inhibition of rat glioma cell migration and proliferation by a calixarene scaffold exposing multiple Glc NAc and ureido functionalities〔J〕.J Neurochem,2008;107(4):1047-55.

6 Gdynia G,Grund K,Eckert A,et al.Basal caspase activity promotes migration and invasivenessin glioblastoma cells〔J〕.Mol Cancer Res,2007;5(12):1232-40.

7 Bhattacharjee M,Acharya S,Ghosh A,et al.Bax and Bid act in synergy to bring about T11TS-mediated glioma apoptosis via the release of mitochondrial cytochrome c and subsequent caspase activation〔J〕.Int Immunol,2008;20(12):1489-505.

8 Stegh AH,Kesari S,Mahoney JE,et al.Bcl2L12-mediated inhibition of effector caspase-3 and caspase-7 via distinct mechanisms in glioblastoma〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2008;105(31):10703-8.