氧化应激对 D-半乳糖致衰老小鼠的影响

张林波 黄 帅 马广丽 吴红珍 姚 华 章 宏

(吉林农业大学生命科学学院,吉林 长春 130118)

近几十年来随着老年医学的发展,有关氧化应激与衰老的研究日益增多,目前对氧化应激在衰老发生发展中的作用已经有了一定程度的了解。本文在国内外相关研究的基础上,通过D-半乳糖腹腔注射建立衰老动物模型,通过生化、免疫手段系统观察氧化应激与衰老发病机制间的关系,旨在为衰老机制及抗氧化药物开发奠定一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 20只 5～8周龄雄性昆明鼠,体重18～25 g(购自吉林大学实验动物学部),自由摄食、饮水饲养 1 w,室温 22℃～25℃。随机分为正常组和模型组,每组 10只。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 D-半乳糖(Sigma公司,临用前用0.9%生理盐水配成浓度为3mg/ml的溶液,0.22μm滤膜过滤除菌),四甲基偶氮唑盐(MTT)、ConA(北京鼎国公司),超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)生化检测试剂盒及考马斯亮蓝蛋白质定量试剂盒(南京建成生物工程研究所),722型分光光度计(北京普析通用仪器有限公司),CO2培养箱(INCUBATOR),酶联免疫检测仪(美国 Bio-Rad公司)。

1.2.2 衰老模型的建立 参照文献〔1,2〕,采用腹腔注射 D-半乳糖的方法建立衰老模型。模型组按每天 150 mg/kg剂量,腹腔连续注射 42d,造成衰老模型。对照组按同等剂量腹腔注射生理盐水。实验期间,各组小鼠自由饮水和进食。

1.2.3 衰老模型的鉴定

1.2.3.1 外观特征鉴定 观察小鼠精神、活动状况、皮毛光泽及皮肤弹性、饮食饮水量、大小便。

1.2.3.2 运动能力鉴定 运动能力的强弱一般通过抗静态疲劳测试和负重力竭性游泳测试两个方面来表现。建模后,与正常组相比,凡小鼠在抗静态疲劳测试和负重力竭性游泳测试中所用时间明显增多者即为成功模型。抗静态疲劳测试(静力性运动能力):取长 2 m、直径 0.5 cm的悬垂导线,将待测小鼠置于距导线末端 12cm处,记录小鼠 3次从抓线至掉落时间。负重力竭性游泳测试(运动性运动能力):小鼠尾负重 100 g/kg,放入 50cm×40cm×30 cm水箱中游泳,水温 28℃±2℃,小鼠连续 3次沉入水中,每次超过 10 s不能浮出水面为力竭,记录小鼠游泳至力竭时间。

1.2.3.3 免疫功能鉴定 通过对免疫器官指数和脾淋巴细胞增殖活性的测定来衡量机体的免疫功能。建模后,与正常组相比,凡小鼠的免疫器官指数(胸腺和脾脏指数)和脾淋巴细胞增殖活性明显降低者即为成功模型。免疫器官指数(胸腺指数、脾脏指数)的测定:实验结束后,将小鼠称重,各组小鼠经摘眼球取血后,脱颈椎处死,75%酒精浸泡消毒,无菌开腹取脾脏、胸腺,用电子称称重,以脏器湿重(mg)/体重(g)表示小鼠脾脏指数和胸腺指数。即脾脏指数 =脾脏重量(mg)/小鼠体重(g);胸腺指数 =胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)。脾淋巴细胞增殖活性的测定采用 MTT法。

1.2.3.4 血清、脑组织中SOD、MDA的检测 总 SOD(T-SOD)活力的测定采用黄嘌呤氧化酶法,MDA的测定采用硫代巴比妥酸法。脑组织中 SOD、MDA的检测需先制备 10%脑组织匀浆后再进行测定。具体步骤按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学分析 用SPSS13.0统计软件进行数据处理,实验结果以 x±s表示,组间差值采用 t检验。

2 结 果

2.1 小鼠外观特征的比较 模型组小鼠逐渐出现精神萎靡,眯眼、扎堆,反应迟钝、行动迟缓,毛色枯槁无光泽、散乱竖起,皮肤弹性差,饮食饮水量减少,大便较稀、有腥臭,逐渐消瘦。正常组小鼠精神好,行动敏捷;毛发光泽、顺滑,皮肤弹性好,大便成形,呈黄褐色,无腥臭。

2.2 小鼠运动能力的比较

2.2.1 小鼠抗静态疲劳测试的比较 正常组小鼠抓绳时间〔(3.39±0.36)min〕较模型组小鼠抓绳时间〔(1.10±0.21)min〕显著延长(P＜0.01)。

2.2.2 小鼠负重力竭性游泳测试的比较 模型组小鼠游泳至力竭时间〔(25.75±1.37)min〕显著缩短于对照组〔(50.21±2.56)min〕(P＜0.01)。

2.3 小鼠免疫器官指数(脾脏、胸腺指数)的比较 见表 1。与正常组比较,模型组小鼠脾脏指数和胸腺指数均显著降低(P＜0.01)。

表1 小鼠免疫器官指数比较(mg/g,x±s)

2.4 小鼠脾淋巴细胞增殖活性的比较 无菌分离正常鼠脾脏淋巴细胞,用不同浓度的 ConA测定脾淋巴细胞增殖反应,ConA 100μg/μl刺激指数为 1.64±0.07,ConA 50 μg/μl为2.23±0.11,ConA 5 μg/μl为 1.28 ±0.09。 可 见 ConA 50μg/μl刺激指数最高,故本实验采取 50μg/μl的 ConA进行刺激。与正常组比较,模型组小鼠脾淋巴细胞增殖活性(1.41±0.14)显著低于对照组(2.22±0.11)(P＜0.01)。

2.5 小鼠血清、脑组织中 SOD活性的比较 见表 2。与正常组比较,模型组小鼠血清、脑组织中SOD活性均显著降低(P＜0.01)。

表2 小鼠血清、脑组织中SOD活性(x±s)

2.6 小鼠血清、脑组织中MDA含量的比较 见表 3。与正常组比较,模型组小鼠血清、脑组织中MDA含量均显著升高(P＜0.01)。

表3 小鼠血清、脑组织中MDA含量(x±s)

3 讨 论

3.1 D-半乳糖致衰老动物模型的建立与评价 目前衰老的动物模型大致分为 4类:(1)中医衰老理论指导下制备的动物模型,包括肾虚、脾虚、阴虚、阳虚、气虚、血虚、血淤衰老模型等〔3,4〕;(2)根据现代衰老学说制备的衰老模型,包括根据衰老的自由基学说制备的 O3损伤衰老模型〔5〕,根据衰老的代谢学说制备的 D-半乳糖致衰老动物模型,根据衰老的免疫学说制备的去胸腺衰老模型〔6〕;(3)直接采用老龄动物作为自然衰老模型;(4)快速老化模型小鼠。其中 D-半乳糖致亚急性衰老模型与自然衰老状态最为相似,且造模周期短、衰老变化明显、模型稳定、重复性好,是国际上较为公认的衰老模型,应用最为广泛。D-半乳糖致衰老模型是由我国学者龚国清等〔7〕首先提出。研究发现该模型在一定时间内通过连续腹腔注射D-半乳糖,使机体细胞内半乳糖浓度升高,在醛糖还原酶催化下还原成半乳糖醇。半乳糖醇为代谢终产物,这种物质不能被细胞进一步代谢而堆积在组织细胞内,影响正常渗透压,导致细胞肿胀、功能障碍和代谢紊乱,造成细胞损伤,最终导致机体衰老〔8,9〕。研究表明 D-半乳糖在其氧化酶的作用下,氧参与反应,可在体内产生大量自由基;而糖代谢的紊乱也影响到细胞抗氧化酶的合成,从而使细胞清除自由基的能力下降,这些都导致自由基的堆积,从而诱发氧化应激,引起脂质过氧化作用的链式反应,导致细胞膜损伤。同时过氧化脂质的分解终产物如 MDA可与DNA或RNA及蛋白质和磷脂的有关物质结合,使细胞膜成分改变、功能障碍,从而使得动物多种组织、器官形态以及生理、生化指标出现明显退行性变化,促进衰老〔10〕。

3.2 氧化应激、SOD、MDA与衰老 氧化应激是活体内细胞或组织活性氧族及其结构和功能改变的不断累积〔11〕,打破了体内氧化与抗氧化体系之间的平衡关系,使自由基产生过多或清除能力下降,自由基的产生与清除失去平衡,引起衰老和多种疾病。SOD是一种重要的抗氧化酶类,长期以来被作为衰老与抗衰老研究的经典指标。衰老期间的确存在着 SOD变化,这种变化不仅包括活性或含量上减少,而且包括性质上发生的变化;不仅包含整体上的变化,而且也包括离体组织和细胞水平上的变化,因此SOD活性的高低反映了机体清除自由基的能力。MDA是脂质过氧化终产物之一,可与蛋白质、核酸及某些磷脂交联形成 Schiff碱,可使细胞结构呈退行性改变,加速细胞老化过程。MDA含量高低反映了氧自由基水平和过氧化反应的强度和速率,可以间接反映细胞受损程度,是公认的可靠衰老指标。SOD活性的降低可反映出机体氧化与抗氧化之间的平衡被破坏,并且清除自由基的能力也下降;MDA含量的升高可反映机体氧自由基的水平过高和氧化反应的速率过快,并且机体受损害的程度加大。这些都说明SOD、MDA与衰老的发生有一定的关系,这两个指标的变化也证实了机体内发生了氧化应激反应,进一步说明氧化应激参与了衰老的发生。

1 马 虹,徐 镰,田苏平,等 .不同水温游泳对小鼠行为、记忆和脂质过氧化影响差异的研究〔J〕.中国应用生理学杂志,1999;15(3):222-5.

2 蔡曦光,许爱霞,葛斌等 .菟丝子多糖抑制衰老小鼠模型中氧自由基域的作用〔J〕.第三军医大学学报,2005;27(13):1326-8.

3 董六一,范 丽,李桂芳,等 .银杏总内酯对衰老模型小鼠的作用〔J〕.药学学报,2004;39(3):176-9.

4 冀敦福,季海刚.关于衰老与老年病中医机制的探讨〔J〕.天津中医学院学报,2004;23(4):169-73.

5 周文泉,刘建华.中西医结合延缓衰老的研究近况及展望〔J〕.中国中医药信息杂志,1997;4(8):8-10.

6 杜怀棠,周丽珍.近 10年中医衰老学说研究述评〔J〕.北京中医药大学学报,1995;18(2):2-7.

7 陈友琴,胡新珉,刘鸿莲,等 .YN-PTOL对 O3衰老模型自由基损伤的保护作用〔J〕.中国医学物理学杂志,2000;17(1):57-8.

8 崔英俊,李庆章.滑菇多糖对衰老模型鼠不同时期免疫功能的影响〔J〕.东北农业大学报,2004;35(2):129-34.

9 龚国清.小鼠衰老模型的研究〔J〕.中国药科大学学报,1991;22(2):101-3.

10 Song X,Bao M,Li D,et al.Advanced glycation in D-galactose induced mouse aging model〔J〕.Mech Aging Dev,1999;108(3):239-51.

11 陈 勤.抗衰老研究实验方法学〔M〕.北京:中国医药科技出版社,1996:46.