Smac/DIABLO与肿瘤治疗的研究进展

魏 巍 初 明 刘 爽

(佳木斯大学附属第一医院骨二科,黑龙江 佳木斯 154002)

靶向性治疗一直是肿瘤治疗的研究热点,肿瘤细胞与正常细胞区别主要在于:肿瘤细胞具有无限增殖,逃避凋亡,组织侵袭性以及转移的能力。如何在治疗过程中只杀死肿瘤细胞而不影响正常细胞是治疗肿瘤的难点。Smac/NIABLO是 2000年首先由 Wang等〔1〕发现并报道,命名为第 2个线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂(second mitochondria-derived activator of caspase,Smac),确定其位于线粒体中,在凋亡过程中与细胞色素 C一同由线粒体中释放出来,与细胞凋亡密切相关。同年,Vaux等〔2〕也报道了这个蛋白,命名为低等电点凋亡抑制蛋白(IAPs)直接结合蛋白(direct IAP-binding protein with low pI,NIABLO)。经过比对分析证实两者为同一种蛋白,即命名为Smac/NIABLO蛋白。近年来,Smac/NIABLO只诱导肿瘤细胞凋亡而不影响正常细胞的特点引起各国研究人员的注意,希望可以将其应用于肿瘤靶向治疗。

1 Smac/NIABLO蛋白的生物学特性

人类 Smac/DIABLO基因位于 12号染色体长臂,由 7个外显 子 组 成。Smac/DIABLO有 Smac/DIABLO-L、Smac/DIA 2BLO-S和野生型 Smac/DIABLO 3种存在形式。Smac/DIABLO-L、S蛋白存在于线粒体内;而野生型的 Smac/DIABLO蛋白以纯二聚体的形式存在于线粒体的膜间隙内〔3,4〕。

Smac/NIABLO分子的 N端是由 55个氨基酸构成的信号肽序列,Smac/NIABLO前体在进入线粒体后立即被水解去信号肽,只有水解后的Smac/NIABLO才具有活性。经 Western印迹实验测出有功能活性的Smac/NIABLO是 184个氨基酸残基,分子量约 21 000〔3,4〕。在 2.2 A分辨率的 X线下,Smac/NIABLO单体是一个延伸的 3个螺旋多肽链组成的束状结构,有中度弯曲,呈拱形。在生理缓冲液中,天然Smac/NIABLO呈二聚体状态。单体型 Smac/NIABLO不能解除XIAP对 caspase的抑制作用。这说明 Smac/NIABLO二聚体状态对其功能来说是必需的〔5,6〕。 2002年 GuoO等准确定位 Smac/NIABLO的功能集团,即 N端前 5个残基与其活性紧密相关〔7〕。用甲硫氨酸代替Smac/NIABLO其 N端的丙氨酸,则Smac/NIABLO完全不能与IAPs的BIR区域紧密结合而发挥其作用。当Smac/NIABLO缺失其 N端的前 4个氨基酸残基(A-V-P-I)时,其与 IAPs的结合能力极度减弱。可见 Smac/NIABLO的功能集团主要位于 N端,C端辅助其与 IAPs结合紧密〔8〕。在抗肿瘤药物的开发上,分子量小的蛋白在应用上更加好操作,更少副作用,因此研究人员更加青睐 Smac/NIABLO蛋白的N端小肽。

2 Smac/NIABLO对细胞凋亡的调控作用

2.1 细胞凋亡的信号途径 细胞凋亡是一个复杂的生理过程。一般认为细胞凋亡分为受体凋亡途径与线粒体凋亡途径,包括 3个阶段:诱导期(induction phase)、效应期(effector phase)、降解期(degradation phase)。各种刺激经相应受体,通过效应分子相互作用引起 caspase家族的级联反应,降解细胞内容物,随之出现细胞凋亡现象。其中 caspase酶的级联反应被视为大多数凋亡过程中细胞死亡效应期的关键反应,因此控制 caspase的级联反应就是控制细胞凋亡的枢纽。虽然受体途径与线粒体途径所引发的 caspase级联反应途径不同,但在某些水平是相互联系的(如图 1所示)。

图1 细胞凋亡信号传导示意图

2.2 Smac/NIABLO调控细胞凋亡的机制 细胞凋亡每一步骤都受到严格精确的调控。Bcl-2蛋白家族可以激活 caspase酶原,诱导细胞凋亡,而凋亡抑制蛋白家族(IAPs)可以抑制caspase的级联反应,从而阻断细胞凋亡进程〔9〕。Smac/NIABLO可以与 IAPs家族成员 XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2、survivin等蛋白分子普遍反应,通过除去IAPs的抑制作用使caspase酶原活化,进而达到促使细胞凋亡的作用。Smac/NIABLO能与IAP反应是因为 IAP家族的所用成员都至少含有 1个 BIR基序。实验表明,不同的BIR区域表现出不同的功能,在 Fas诱导的凋亡中,内源性的 XIAP水解成为二部分,每一部分都有不同的caspase的特异识别位点,XIAP的第二个BIR区域(BIR2)表现出强的抑制凋亡的能力,而BIR1区域与BIR3区域却未显示出同样活性〔10〕。实验数据显示 Smac/NIABLO可与 XIAP的 BIR2和 BIR3区域稳定反应,而与 BIR1区域则无反应。另外,BIR2、BIR3在与Smac/NIABLO结合过程中互相排斥,提示它们可能识别Smac/NIABLO的同源基序。BIR2可以抑制成熟caspase-3的催化活性,而 Smac/NIABLO与 BIR2区域结合可解除其抑制。在凋亡因子刺激下,位于细胞膜上的 caspase-8活化,但被XIAP阻滞,这需要Smac/NIABLO由线粒体中释放来中和XIAP的作用,才允许 caspase-8直接激活效应器,导致细胞凋亡〔11〕。由此可见 Smac/DIABLO和 IAP是一种竞争性作用,因此可以通过增加Smac/DIABLO表达量实现促进细胞凋亡的目的。此外 Smac/DIABLO还具有其他机制来调节IAP功能。研究发现,Smac/DIABLO可以选择性地使 c2IAP1和 c2IAP2泛素化降解而导致两者浓度降低〔12〕,这样可以进一步增加 Smac/DIABLO的相对浓度,促进细胞凋亡。

3 Smac/NIABLO在肿瘤治疗中的应用

3.1 Smac/NIABLO与肿瘤进展的相关性 对于 Smac/NIABLO与肿瘤分期以及癌组织分型的相关性目前结论尚未统一。有的研究发现 Smac/NIABLO在恶性程度高、低分化的肾细胞癌中蛋白表达水平明显低于恶性程度低、高分化的肾细胞癌〔13〕,在肺癌的进展过程中 Smac/NIABLO的表达水平降低。而有的研究则发现 Smac/NIABLO蛋白表达水平与肿瘤分期及癌组织分型无关,或者蛋白表达水平与 mRNA表达水平不一致。目前可以达成共识的是,Smac/NIABLO与XIAPs的比值在Ⅲ期肿瘤中明显高于Ⅰ期与Ⅱ期肿瘤,在高转移性肿瘤中明显高于原位癌〔14〕。可见肿瘤进展过程是一个复杂的多方面作用的综合结果,其中Smac/NIABLO与 IAPs蛋白的比值在肿瘤细胞逃避凋亡、无限制的增殖过程中有重要意义。

3.2 Smac/NIABLO与肿瘤治疗 自 2003年 Kashkar等〔15〕报道过表达 Smac/NIABLO可以促使神经母细胞瘤凋亡,这一发现推动了 Smac/NIABLO作为生物靶向分子,辅助抗肿瘤药物的研究。例如,乳癌MCF-7细胞系属于恶性度高、对诱导凋亡药物不敏感的细胞,利用哺乳动物 GFP-Smac/NIABLO表达系统使其在细胞质中表达 GFP-Smac/NIABLO融合蛋白,并转变为对死亡受体敏感的细胞〔16〕。研究表明,过表达 Smac/DIABLO可以使肿瘤细胞对凋亡刺激更加敏感。在种植肝癌细胞株的裸鼠模型,局部注射可以高表达 Smac/NIABLO的腺病毒载体与 5-氟尿嘧啶,发现肿瘤细胞出现大量凋亡,瘤块明显缩小甚至消失〔17〕。尤其是Smac/NIABLO蛋白 N端分离下来的短氨基酸序列也可与 XIAP反应,作为 caspases的活化剂提高caspase-9、caspase-3的活化能力,一定浓度还可以杀伤 IAPs过表达的肿瘤细胞。Christina等〔18〕采用 Smac蛋白衍生的含有A-V-P-I氨基酸基序的小分子肽能增强细胞凋亡和多种抗瘤药物的治疗效果。对不同肿瘤细胞系的研究发现,高表达 Smac小肽可促进肿瘤细胞凋亡并增加肿瘤细胞对化疗的敏感性,但Smac/DIABLO并不诱导正常的细胞凋亡〔14〕。因此联合 Smac小肽和抗癌药物进行肿瘤治疗,一方面可以增加药物效果,另一方面还可以减少药物毒性。由此可见,Smac/DIABLO小肽分子作为抗肿瘤药物的辅助剂与抗癌药物联合应用具有广泛的应用前景。

4 展 望

虽然目前在一些肿瘤细胞中发现Smac/NIABLO蛋白表达水平与 mRNA表达水平不一致之类的问题尚未完全解决,但对于 Smac/NIABLO蛋白近 10年的研究过程中,将细胞凋亡的基础研究工作向更深层次推进,令细胞凋亡机制的细节更完善;而且研究开发了 Smac/NIABLO蛋白对肿瘤临床治疗的应用价值,使得在肿瘤的生物大分子治疗方面有了重大突破。

1 Du C,Fang M,Li Y,et al.Smac,a mitochondrial protein that promotes cytochrome dependent caspase activation by elimination IAP inhibition〔J〕.Cell,2000;102(1):33-42.

2 Verhagen AM,Ekert PG,Pakusch M,et al.Identification of DIABLO,a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins〔J〕.Cell,2000;102(1):43-55.

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5 Chai J,Du C,Wu JW,et al.Structural and Biochemical Basis of Apoptosis Activation by Smac/DIABLO〔J〕.Nature,2000;406(6798):855-63.

6 Srinivasula SM,Hegde R,Saleh A,et al.A conserved XIAP interaction motif in caspase-9and Smac/DIABLOregulates caspase activity and apoptosis〔J〕.Nature,2001;410(6824):112-26.

7 Guo F,Nimmanapalli R,Paranawthana S,et al.Ectopic over expression of second mitoch-ondria derived activator of caspases(Smac/DIABLO)or co treatment with N-terminals of Smac/DIABLO peptide potentiates epothilone B derivative(BMS247550)and apo-2L/TRAIL induced apoptosis〔J〕.Blood,2002;99(9):3419-7.

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9 Deveraux Q1,Takahashi R,Salvesen GS,et al.X-linked IAP is a direct inhibitor of cell death proteases〔J〕.Natrue,2007;388(6639):300-11.

10 Vucic D,Deshayes K,Ackerly H,et al.Smac negatively regulates the anti-apoptotic activity of melanome inhibitor of apoptosis(ML-IAP)〔J〕.Biol Chem,2006;277(14):71-5.

11 Ng CP,Bonavida B.X-linked inhibitor of apoptosis(XIAP)blocks Apo-ligend/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-mediated apoptosis of prostate cancer cellsin thepresenceof mitochondrial active-tion:sensitization by over expression of second mitochondria-derived acti-vator of caspase/direct IAP-binding Protein with Low pI(Smac/DIABLO)〔J〕.Mole Cancer Therapeut,2006;1(3):1051-9.

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18 Christina R,Mihnea V,Michael P,et al.Synthetic Smac/DIABLO peptides enhance the effects of chemotherapeutic agents by binding XIAP and cIAP1 in situ〔J〕.Biol Chem,2002;277(46):4-13.