雌激素对 AD大鼠模型 N-甲基-D-天冬氨酸受体表达的影响

商秀丽 沈向宏 赵润秋 赵久晗 曹云鹏

(中国医科大学附属第一医院神经内科,辽宁 沈阳 110001)

流行病学研究表明阿尔茨海默病(AD)发病年龄一般在 65岁以上,约 33%的女性和 20%的男性可能发生AD,在未来 50年内,AD的发病率将达到现在的 4倍〔1〕。AD女性发病率较男性高,可能是由于绝经后妇女缺乏内源性雌激素保护。雌激素替代治疗是防治 AD的方法之一,但对于其在中枢神经系统中的作用机制尚不清楚。我们认为AD模型大鼠学习、记忆能力下降可能与 N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)蛋白表达的变化有关〔2〕。为进一步探讨雌激素对 AD动物模型的学习、记忆能力的影响及可能机制,本研究拟采用立体定位注射的 AD动物模型,检测雌激素剥夺和替代治疗对动物模型学习和记忆的影响,并进一步探讨雌激素保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物分组 健康 SD雌性大鼠 30只,3～4月龄,体重 200～250 g(中国医科大学动物部提供),随机均分为雌激素替代治疗(ERT)组和卵巢切除术(OVX)组。

1.2 双侧卵巢切除术 剪开大鼠腰背部皮肤,切口约 2.0～3.0cm,先使动物右侧卧位,在最末肋骨下缘 1 cm处沿脊柱旁切开肌肉,打开腹腔,将肾脏下方的脂肪拉出可见红色颗粒样腺体为卵巢,结扎并切除卵巢,观察切口处无出血后关腹;使动物转向左侧,同样方法取出右侧卵巢〔3〕。注意无菌操作,皮肤切开处给予少许青霉素粉剂,缝合切口。

1.3 雌激素替代治疗 2w后ERT组给予苯甲酸雌二醇替代治疗,肌肉注射苯甲酸雌二醇 0.2mg/kg(上海通用药业股份有限公司提供,批号:31021114),共 30 d。OVX组给予同等剂量的橄榄油。

1.4 AD动物模型制备 β-淀粉样肽(Aβ)由美国 Sigma公司提供。 首先 将 Aβ1～40孵育,用生理 盐水将 Aβ1～40稀释成10μg/μl,37℃孵育 1 w,使其变为聚集状态的 Aβ1～40。 SD大鼠 10%水合氯醛 (300 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立体定位仪上,常规备皮消毒,切开头部皮肤,暴露硬脑膜。定位海马齿状回背侧细胞带 (前囟后 3.3 mm,旁开 1.5 mm,颅骨表面下3.3mm)。微量进样器自脑表面垂直进针,缓慢将 Aβ1～401μl(10μg/μl)注入,注射速度为 5 μl/h,留针 0.5 h,使 Aβ1～40充分浸润局部组织,缝合切口,常规饲养。

1.5 Morris水迷宫测定 待 Aβ1～40注射 2 w后再测水迷宫潜伏期。即记录大鼠从入水到找到并爬上平台的时间,此时间称逃避潜伏期。每一时间段内 4次潜伏期的算术平均数为这一时段的成绩进行统计分析。

1.6 取材及NMDAR1蛋白表达检测 2 w后,10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后立即断头取脑,剥离大脑并沿正中线分两个半球,在冰冷生理盐水中漂洗后置于液氮中保存。在恒冷箱 (-20℃)切片机上做 15μm连续切片,将其贴于APES包被的载玻片上晾干,于含 0.1%DEPC的 4%多聚甲醛溶液中固定 10min,然后在 0.1%DEPC水中漂洗、晾干,置于 -70℃冰箱备用。NMDAR1蛋白免疫组织化学试剂盒为兔抗大鼠多克隆抗体,由武汉博士德公司提供。切片脱蜡至水,抗原修复,加正常山羊血清室温下封闭 30～60 min,滴加兔抗 NMDAR1抗体 (1∶200),37℃水浴中孵育 2 h,再滴加羊抗兔 IgG(二抗)37℃水浴中孵育 30 min,最后以DAB、H2O2显色液室温显色 5 min终止。水洗、脱水及封片后,光镜下观察。用图像分析仪分别测海马 CA 1、CA 2、CA3、DG及额叶皮层的平均灰度值。

1.7 统计学分析 实验数据用 x±s表示,使用 SPSS11.5软件包进行 t检验。

2 结 果

2.1 Morris水迷宫结果 行为学研究结果显示 ERT组 AD大鼠的水迷宫逃避潜伏期与 OVX组相比明显缩短(P＜0.05),见表 1,表明雌激素替代治疗能改善 AD动物模型的空间学习记忆能力。

表1 AD模型大鼠水迷宫实验结果(x±s,n=15,s)

2.2 NMDAR1免疫组化结果 ERT组 AD动物模型的海马CA1、CA3区及额叶皮质的 NMDAR1表达阳性细胞与 OVX组相比明显增多(P＜0.05),ERT组AD动物模型的海马 CA1、CA3区及额叶皮质的 NMDAR1蛋白表达的平均灰度值与 OVX组相比显著降低(P＜0.05),表明雌激素替代治疗可以上调AD动物模型 NMDAR1的蛋白表达。见图 1,表 2。

图1 AD模型大鼠 NM DAR 1蛋白表达(×400)

表2 各组大鼠NMDAR1蛋白表达(x±s,n=15)

3 讨 论

本研究利用 Aβ立体定位单侧海马内注射建立 AD动物模型,通过水迷宫实验检测动物模型行为学的学习记忆能力改变,免疫组化方法检测 NMDAR1蛋白表达情况。结果显示ERT组AD动物模型的水迷宫逃避潜伏期较OVX明显缩短,同时 ERT组 AD动物模型的海马 CA 1、CA 3区及额叶皮质的NMDAR1的蛋白表达上调,表明雌激素替代治疗可以改善AD动物模型的认知功能,其神经保护作用可能与上调 NMDAR1的蛋白表达有关。

NMDAR是目前研究最为深入的兴奋性氨基酸受体之一,是一种离子型受体。NMDAR在哺乳动物中枢神经系统内从大脑皮层到脊髓都有广泛分布,其中以大脑皮层和海马结构的密度最高。NMDAR蛋白之 cDNA表达两个亚单位,即 NMDAR1和 NMDAR2,其中 NMDAR1具有 NMDAR的一切药理学和电生理学特性,是必需功能亚基,而 NMDAR2蛋白单独存在时并不表现受体活性,只是在与 NMDAR1蛋白结合后对其功能及特性起辅助修饰作用。而且 NMDAR1的分布可以代表整个NMDAR的分布情况,因此本研究仅对 NMDAR1的表达进行检测即可以反映 NMDAR表达的改变。

本研究结果表明雌激素替代治疗可以改善 AD动物模型的认知功能,其机制可能与上调 NMDAR1的蛋白表达有关。有关雌激素对中枢神经系统疾病保护作用的研究显示,雌激素无论是在 Aβ作用之前、之后,还是二者同时给予,均可阻断 Aβ的神经毒作用;提前给予时,作用最为显著,提示雌激素不但可防止 Aβ沉积,而且还可阻断 Aβ沉积后对神经元的毒性作用〔4〕。另外,NMDAR在突触可塑性的形成中有重要作用。NMDAR电流的易化使电流输入到海马 CA 1区锥体细胞来调整学习和记忆〔5〕。但雌激素具体通过何种机制来调整NMDAR电流目前尚不清楚,NMDAR可能参与介导了多条通路,并在其中发挥了重要作用,最终达到调节学习记忆的能力〔6〕。离体海马脑片研究表明在 AD等变性疾病引起的智能损害中,海马CA1区 NMDAR是减少的,应用适当的NMDAR激动剂可以改善智能障碍,并能明显增加 NMDAR的密度,促进突触体谷氨酸释放,加强海马脑片上 LTP的幅度,脑皮层厚度及海马 CA 1区突触数增加,对学习记忆过程有促进作用〔7〕。研究表明〔8〕雌激素的这种直接调节作用需要NMDA受体和雌激素受体在个体神经元中共同表达,分别在下丘脑的腹正中核和弓状核及扁桃体中 52.5%,61.5%和 51%的神经元中有 NMDAR-mRNA和雌激素受体 mRNA共区域化。两者共同表达支持了谷氨酸受体和雌激素在雌激素作用的女性生殖行为和神经内分泌功能区中具相互作用。Adams等发现雌激素对 NMDAR体在 CA1区域突触和亚突触上锥体细胞的分布具有影响,可使老化的CA1区中 NMDAR水平上升至年轻水平〔9〕。而我们的研究结果显示,大鼠大脑皮质神经细胞有适量 NMDAR1的表达,ERT组的 AD大鼠模型的NMDAR1在海马及额叶皮层中表达上调,表明 NMDAR1的表达的改变参与了雌激素改善 AD大鼠模型的学习记忆的病理生理过程,因此我们推测雌激素的脑保护作用可能与调节 NMDAR1的蛋白表达有关。NMDAR1的蛋白表达上调,可能有助于神经功能的代偿和恢复,进而改善大鼠的学习和记忆。

综上,ERT的 AD大鼠模型的NMDAR1的蛋白表达发生改变,而这种改变可能是雌激素导致大鼠学习记忆改善的分子机制之一。本研究为 NMDAR1在雌激素治疗 AD中的作用提供了一个实验证据。为进一步寻找有效措施,充分上调 NMDAR1的蛋白表达,最终改善学习和记忆的能力提供理论依据。

1 Peter P,Michelle C,Brenda L,et al.Hormone replacement therapy and incidence of Alzheimer disease in older women the cathe county study〔J〕.JAMA,2002;288(18):2123-9.

2 Shang XL,Xu WP,Liu YH,et al.Expression of MAPK in the hippocampus of Alzheimer′s disease rats model〔J〕.Neuroscience Bulletin,2005;21(4):296-300.

3 Klein RL,Hirko AC,Meyers CA,et al.NGFgene transfer to intrinsic basal forebrain neuronsincreases cholinergic cell size and protectsfrom agerelated,spatial memory deficits in middle-age rats〔J〕.Brain Res,2000;875(1-2):144-51.

4 Hong-Goka BC,Chang FL.Estrogen receptors alpha and beta in choroids plexus epithelial cells in Alzheimer′s disease〔J〕.Neurosci Lett,2004;360(3):113-6.

5 Giovannini MG,Scali C,Bellucci A,et al.Beta-amyloid-induced inflammation and cholinergic hypofunction in the rat brain in vivo:involvement of the P38 MAPK pathway〔J〕.Neurobiol Dis,2002;11(2):257-74.

6 Bliss TV,Collingridge GL.A synaptic model of memory:long-term potentiation in the hippocampus〔J〕.Nature,1993;361(6407):31-9.

7 Wesnes KA,Faleni RA,Hefting NR,et al.The cognitive,subjective,and physical effects of a ginkgo biloba/panax ginseng combination in healthy volunteers with neurasthenic complaints〔J〕.Psychopharmacol Bull,1997;33(4):677-83.

8 Kia HK,Yen G,Krebs CJ,et al.Colocalization of estrogen receptor alpha and NMDA-2D mRNAs in amyloid and hypothalamic nuclei of the mouse brain〔J〕.Mol Brain Res,2002;104(1):47-54.

9 Adams MM,Fink SE,Janssen WG,et al.Estrogen modulates synaptic N-methyl-D-asparate receptor subunit distribution in the aged hippocampus〔J〕.Comp Neuorl,2004;474(3):419-26.