酶动力学中的拟稳态定律介绍

李邦河， 李 博,2, 沈跃峰,2

(1.中国科学院 数学与系统科学研究院，北京 100190;2.中国科学院 研究生院，北京 100049)

生命系统中几乎所有的化学反应都有酶这种生物催化剂的参与,对酶进行研究可以帮助人们更好地理解生命过程,现在已知的大部分酶都是蛋白质.与其他化学催化剂相似，酶是通过降低反应物和产物之间的自由能壁垒来提高化学反应速度的.但是，酶与一般化学催化剂又有着明显的不同:它们拥有比一般无机化学反应高出好几个数量级的催化能力；可以在更加温和的环境下(如常温、常压和近乎中性的条件下)进行催化反应；具有更高的反应专一性，这点使得酶催化反应几乎没有副产物.此外，酶的催化能力可以受非底物物质浓度的调节[1-2].

酶动力学是研究酶催化反应速率的学科,并通过对催化速率及其在不同条件下的变化规律的研究来推断反应机制.这是一种最古老并且仍然被认为是最重要的推断催化机制的方法.早在1892年，Brown研究了有酵母存在的蔗糖发酵过程,发现当蔗糖浓度高于酶浓度时，反应速率反倒与蔗糖浓度无关[3];1902年，他提出这一现象可以由反应过程中形成了酶与底物的符合物来解释[4].在高底物浓度下，由于酶的供给相对较少，此时的酶都是以复合物的形式存在的.因此，进一步增加底物浓度并不能再增加复合物.而产物的生成速率与复合物的浓度有关，因而底物浓度的增加几乎不会影响反应物的生成速率.这一推断被认为是酶动力学的开端，即首次利用化学反应速率的性质推导出反应机制.关于Brown提出的模型及其后来的发展，可参阅文献[5].几乎在同一时期，Henri提出了2个单底物S单产物P反应机制模型[6].在每个模型中，酶E与底物S都形成了复合物C.本文将着重介绍其中研究最广泛的一个，即后来以Michaelis-Menten命名的模型.另一个模型的简介可以参阅文献[7].这些模型均以化学动力学中的质量作用定律(Law of Mass Action)为基础，因此先简单介绍一下质量作用定律.

1 质量作用定律

一个化学反应过程可以通过一系列的基本反应(elementary reaction)而发生,而基本反应则是指只经过1个暂态(transtion state)的反应.Guldberg和Wagge在前人的基础上，于1864年提出了化学反应速率与反应物的有效质量成正比[8],即质量作用定律，其中有效质量实际是指浓度.实际上，质量作用定律只对基本反应成立.用现在通行的名词来描述，该定律为：恒温下，基本反应的速率同反应物浓度幂次的积成正比，幂次的大小等于该反应物在化学反应中参与一次碰撞的分子个数.

2 酶作用的Michaelis-Menten模型

Michaelis-Menten模型描述的是一个单底物单产物的酶催化过程，即酶(E)催化底物(S)转化成产物(P)的过程.这一过程可以分解为2个基本反应，第1个简单反应是可逆过程，第2个简单反应是不可逆的.反应机制如下：

(1)

式(1)中:k1和k-1是形成复合物C的正向和逆向反应速率常数;k2是复合物C分解成产物的速率常数.该模型是酶动力学中最简单的模型.对其进行深入研究，有助于理解酶的催化机制;同时给更复杂的模型研究提供一些思路.

根据质量作用定律，各反应物浓度满足以下微分方程[9]：

dS(t)/dt=-k1S(t)E(t)+k-1C(t);

(2)

dE(t)/dt=-k1S(t)E(t)+(k-1+k2)C(t);

(3)

dC(t)/dt=k1S(t)E(t)-(k-1+k2)C(t);

(4)

dP(t)/dt=k2C(t).

(5)

给定初始条件

(S(0),E(0),C(0),P(0))=(S0,E0,0,0).

(6)

式(2)～式(6)中,E(t)，S(t)，C(t)以及P(t)分别表示反应时刻t时的酶、底物、酶底物复合物以及产物的浓度.由物质守恒定律得:

E(t)+C(t)=E0;

(7)

S(t)+C(t)+P(t)=S0.

(8)

方程(5)～方程(8)等价于以下2个方程：

dS(t)/dt=-k1S(t)E(t)+k-1(E0-E(t));

(9)

dE(t)/dt=-k1S(t)E(t)+(k-1+k2)(E0-E(t)).

(10)

给定初始条件(S(0),E(0))=(S0,E0).方程(9)和方程(10)不是显式可解的，生物学家们为了进一步的研究，作了一些假设来简化问题.

1913年，德国生化学家Michaelis和他的加拿大助手Menten在Henri工作的基础上，提出了平衡假设(assumption of equilibrium)[10].假设k-1≫k2，第1步反应相对于第2步快速达到平衡.在平衡状态时，

(11)

式(11)中,K为酶反应第1步的解离常数.根据这一假设，产物的生成速率可以表示为

(12)

在此基础上可以研究酶的动力学性质.

注意到，平衡假设只有当第2步反应速度相对于第1步反应很慢(体现在k-1≫k2)，而且第2步反应不会干扰到第1步反应时才成立.实际上，这些条件在通常生理条件下往往是不能达到的，因此这一假设有很大的局限性.

3 拟稳态假设

1925年，Briggs和Haldane指出平衡假设中酶、底物和复合物之间的快速平衡不一定总存在，因此提出了一个更通用的假设，即稳态假设[11].在此直接引用著名生物化学教科书中的描述[2]:

在通常生理条件下，当底物浓度远超过酶浓度时(S0≫E0)，除反应起始阶段外，该阶段一般在E和S混和的几μs之内，C(t)保持近似常数，直至底物几乎耗尽.因而C合成的速率，在反应的大部分历程中必定与其消耗的速率相等，亦即C保持稳态，C(t)可以当作常数来处理

dC(t)/dt=0.

(13)

由于在反应中，复合物浓度C(t)保持近似常数，即

dC(t)/dt≈0,

(14)

所以后来常常称这个假设为拟稳态假设(quasi-steady state assumption)[12].

由该假设知，当方程(13)成立时，有

k1S(t)E(t)-(k-1+k2)C(t)=0.

(15)

将方程(15)代入方程(7)，整理可得

(16)

(17)

记反应进入稳态时的产物生成速度为v0，而此时的S(t)几乎等于S0,于是

(18)

式(18)中,Vmax=k2E0.在之前的文献中称Vmax为最大速度,这是因为

(19)

实际上这一速度是个上界，永远也达不到.

由于方程(17)的形式与方程(12)相同，为了承认和纪念Michaelis和Menten的贡献，方程(18)被称为米氏(Michaelis-Menten)方程，这是酶动力学的基本方程.

继Briggs和Haldane的工作后，拟稳态假设便成了酶动力学中的基本假设.围绕着这一假设及米氏方程，生化学家们做了大量卓有成效的工作.人们找到了微分方程(9)和(10)的一些近似解析解[13].Lineweaver和Burk发现米氏方程的倒数形式可以用来估计反应常数Vmax和KM[14].这样,k2便可以由Vmax=k2E0求出来.事实上，该倒数形式给出了1/v0，1/S和1/Vmax的线性关系，所以只需要对数据进行简单的线性回归就可以估计Vmax和KM.当然这一方法有很大的局限性，它给出的估测值准确度并不高[15]，但因其使用简单、较直观，且由它给出的解在没有计算机的时代已经相当不错了，因此很多教科书还是会花一定的篇幅去介绍它[1,16-17].除此方法外，一些更精确的基于拟稳态假设米氏方程的方法也被提了出来[18-20].

拟稳态假设不但可以应用在酶动力学中,还可以应用到任何有类似动力方程的生化过程中，用以简化复杂的系统.实际上，这一假设已被用于系统生物学中的代谢过程及基因调控过程[21].

研究酶动力学的所有实验也都表明,在底物浓度远远大于酶浓度时，拟稳态假设及米氏方程给出了酶催化反应一个高度近似的描述[22].在单分子层面上，单个酶分子与溶剂分子发生不间断的碰撞，在溶液中随机游动并与底物发生相互作用[23-24].对单分子酶催化的随机行为进行的统计分析表明，米氏方程仍然成立[22,24-26],即拟稳态假设不只在宏观角度上成立，在微观单分子层面上也是高度符合的.

4 拟稳态假设的合理性研究

尽管很多生化学家都利用拟稳态假设来减少复杂生化反应系统中的方程数量，但对拟稳态假设的合理性和适用范围的理论研究却很少.事实上，拟稳态假设存在着错误地乱用[27].

第1个讨论拟稳态假设的是Laidler[28]，他认为S0≫E0是一个很关键的条件.1988年，Segel通过估计反应中相关的时间尺度，提出了确保稳态假设合理的条件[29].他认为,拟稳态假设成立须满足以下条件：

1)经过一个初始时间段tC(在这段时间内几乎全部酶与底物充分结合形成饱和态的酶-底物复合物)，复合物的浓度C(t)保持近似常数.在初始时间段内，底物浓度几乎不变.

2)底物浓度显著变化的时间段tS要远远大于tC.

根据Segel的第1个条件，当时间t

(20)

在初始值C(0)=0的解为

(21)

(22)

底物浓度显著变化的时间段tS则可以由总的底物浓度除以底物浓度的最大变化速率得到，即

(23)

由于底物的消耗速度在时间t>tC时等于产物的生成速度，所以由方程(17)可得

(24)

于是

(25)

根据Segel的第2个条件tS≫tC，可以得到

(26)

由方程(22)和方程(26)可知，条件

E0≫KM+S0

(27)

可以保证拟稳态假设近似描述单底物酶催化反应的动力学过程.

最近,Hanson等发现初始瞬间(t

5 反拟稳态假设和总拟稳态假设

生物有机体内的拟稳态假设条件在某些时候是不能成立的[31],这种情况下运用拟稳态假设得到的结果准确度非常差[32-33],故一些新的假设被提了出来.E0≫S0是一种极端情形，反向于拟稳态假设条件，即高酶浓度的反应动力学.从生物直觉上考虑，所有底物分子会迅速与酶分子结合在一起，也即可以认为反应过程中没有底物分子的存在.那么,可以认为除了反应起始阶段外，直到反应结束，dS(t)/dt≈0[33].这一假设被称为反拟稳态假设(reverse quasi-steady-state assumption).Schnell和Maini研究了这一假设，认为要使此假设成立，应满足k2≫k1[E]0或者S0≫[E]0.基于此，产物的生成速率可以表示为

(28)

注意到，这一结果竟然与平衡假设得到的结果相同[34],其中的深刻关系还值得进一步研究.

(29)

(30)

同样，他们给出了总拟稳态假设近似成立的条件为

E0+S0≫k2/k1或者k-1≫k2或者KM+S0≫E0.

(31)

最近，Pedersen等将总拟稳态假设应用到更复杂的系统中[36].

6 拟稳态定律

笔者研究拟稳态假设的合理性和扩展它的适用范围都是基于稳态假设，给出了假设成立的必要条件和反应在某些阶段的近似解，但都没有直接从拟稳态假设的条件出发，严格地验证假设的正确性.从数学的严格性来看，这些问题的处理都比较模糊.

基于上述考虑，把拟稳态假设相应地用数学语言重新表述为如下2个版本：

拟稳态定律1给定任意小的正数ε，存在一个正数U，使得当S0>U时，C(t)将在小于ε的时间内，从0增加到E0-ε，然后C(t)一直保持在区间[E0-ε,E0]内，直到S(t)/S0<ε.

文献[37]证明了在S0>U时，拟稳态定律1和拟稳态定律2对于任意正的速率常数k1,k2和k-1都成立.这也就是称其为定律的原因.当然，U的选择与E0，ε和速率常数有关.

拟稳态定律1的证明是通过研究方程(9)和方程(10)确定的S-E相平面的动力学性质得到的.平面S-E的第一象限可以被分成5个部分，其中感兴趣的是:

实际上，L1和L2分别是双曲线-k1S(t)E(t)+(k-1+k2)(E0-E(t))=0和-k1S(t)E(t)+k-1(E0-E(t))=0在S(t)≥0的部分，它们相交于点(0,E0).易知:

(32)

(33)

(34)

(35)

这样可以很容易证明以下几个引理，通过这些引理，拟稳态定律1便可以得到证明.

引理1方程(9)和方程(10)满足初始条件(S(0),E(0))=(S0,E0)的解(S(t),E(t))将在某个时刻T0>0到达曲线L1.

引理3酶浓度E(t)和底物浓度S(t)将下降，直到(S(t),E(t))到达曲线L1，然后它水平穿过L1，进入区域R2并永远保持在该区域中.在R2中，S(t)将不断下降，而E(t)不断增加.最后，(S(t),E(t))将趋向于点(0,E0).

引理4给定酶的初始浓度E0和任意小的正数ε，总存在一个正数U0，如果初始底物浓度S0>U0，则E(t)将在时间ε内下降到小于ε的水平.

拟稳态定律2的证明则相对复杂许多，需要研究如下方程组的动力学性质:

(36)

初值条件为(C(0),V(0))=(0,k1S0E0).有兴趣的读者可参阅文献[37].

7 研究方向探索

酶动力学是一个充满活力的学科，有大量问题值得深入探讨.这是生物学与数学的一个很好的接口.酶动力学中有很多方面需要数学，需要用数学的语言将一些模糊的地方精确化，基本的数学参考书是文献[38-39].笔者在阅读酶动力学方面的文献时发现，该领域还有大量的东西需要严格表述，如反拟稳态假设、总拟稳态假设等等.生物学家们往往有很好的直觉，但他们给出的很多结论都是描述性的.同样，在数学的推导过程中也可以启发一些新的想法.例如，最近我们提出了一种新的方法用以测量Michaelis-Menten模型中所有的参数[40]，这便是一个很好的例子.再者，这些诱导出来的数学问题本身也有数学上的趣味，如最近Calder和Siegel的研究结果[41].我们注意到，方程(9)和方程(10)可以确定一个多项式组，那么一些相关的问题可以用代数几何的方法来解决.事实上，本文的部分结果就是利用代数几何的方法得到的，但是为了使文章易于理解，最后写出来的方法都只用到了分析学的工具.2009年5月,来自里尔大学的Francois Boulier在数学机械化国际会议上(ICMM’09)作了题为《On Applications of differential elimination to modeling problems in Biology》的报告，他利用计算代数几何中的微分消去法研究了拟稳态假设相关问题.由此可见，这一领域可以用很多工具来研究.

本文只是简单回顾了酶动力学中Michaelis-Menten模型的发展历程，并介绍了我们在这一方向上的新成果，希望能以此激发数学工作者的研究兴趣.

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