光诱导金丝桃素对人鼻咽癌细胞CNE-2的毒作用和凋亡研究

王晓利， 王彩虹，2， 郭 懿， 王金林， 张俊松*

（1.深圳职业技术学院，广东 深圳518055；2.华南理工大学，广东 广州510006；3.复旦大学，上海 200433）

光诱导金丝桃素对人鼻咽癌细胞CNE-2的毒作用和凋亡研究

王晓利1， 王彩虹1，2， 郭 懿3， 王金林1， 张俊松1*

（1.深圳职业技术学院，广东 深圳518055；2.华南理工大学，广东 广州510006；3.复旦大学，上海 200433）

金丝桃素；光动力治疗；发光二极管；鼻咽癌；凋亡

目的：探讨以发光二极管为光源，金丝桃素光动力疗法对体外培养鼻咽癌细胞CNE-2的毒作用和凋亡影响。方法：体外培养CNE-2细胞分别加入不同浓度的金丝桃素，另设血卟啉阳性对照组，避光培养6 h，分别用黄色和红色发光二极管照射90 min，积累能量为5.67 J/cm2，培养24 h后用MTT法检测金丝桃素和血卟啉在光照条件下对鼻咽癌细胞CNE-2的影响，并用流式细胞仪进行细胞周期分析和凋亡检测。结果：MTT结果显示光活化金丝桃素和血卟啉呈剂量依赖性抑制鼻咽癌细胞的生长，IC50分别为0.049和0.650 μg/mL；流式细胞仪分析表明金丝桃素经光照后，可使细胞停留在S期和G2期，并诱导细胞凋亡，0.20 μg/mL金丝桃素作用18、28、48 h，凋亡率分别达到9.97%、72.19%、92.24%。结论：金丝桃素经光诱导后，可有效抑制体外培养鼻咽癌细胞的增殖，并诱导鼻咽癌细胞凋亡。

金丝桃素（Hypericin，HY）是贯叶金丝桃（Hypericum perforatum L.）中最具生物活性的物质，属萘并二蒽酮类，具有抗抑郁、抗病毒、抗肿瘤活性。光照条件下，金丝桃素能吸收光子，激发产生单线态氧，破坏细胞膜等，抑制肿瘤细胞生长，即具有光动力活 性［1］。光 动 力 疗 法 （photodynamic therapy，PDT）是随着光纤技术、激光医学和内镜技术发展而兴起的一种治疗肿瘤的新方法，近二十年来，PDT开始进入临床试验，用于头、颈、脑、肺、胰腺、腹腔、胸、前列腺和皮肤等肿瘤的治疗，其中光敏剂和光源的选择是光动力治疗中的关键和核心问题。早期的光敏剂大多是卟啉类衍生物（如血卟啉、光敏素），存在很多不足之处，比如对皮肤有长时光毒性、对肿瘤组织选择性低等［2］。金丝桃素具有与肿瘤亲和性高及毒副作用较低等特点，是一种比较理想的光敏剂。鼻咽癌是东南亚及我国南方各省常见的一种恶性肿瘤，严重危害东南亚及我国南方人民的身心健康。本文以LED为光源，金丝桃素为光敏剂对人鼻咽癌细胞CNE-2的毒作用及凋亡进行了研究探讨。

1 材料和方法

1.1 细胞株

人鼻咽癌CNE-2细胞株为南方医科大学病理研究室惠赠。

1.2 药品与试剂

金丝桃素（Hypericin，HY）（美国Alexis公司）；RPMI1640培养基（美国 Gibco公司）；胰蛋白酶-0.25%EDTA（美国Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT，美国Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国 Sigma公司）、血卟啉（Hematoporphyrin，HP）（美国Sigma公司）；Cycle TESTTMPLUS DNA Reagent Kit、Apo-BRDUTMKit（美国 Becton Dickinson 公司）；其余试剂为分析纯。

1.3 仪器

FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）；Spectramax M2光密度荧光检测仪（美国Molecular Devices公司）；LED光源（深圳佳进光电技术有限公司）；二氧化碳孵箱（德国Binder公司）；倒置荧光显微镜（德国Leica公司）；TQ8210型光纤功率计（日本爱德万公司）；微孔细胞培养板（美国Corning公司）。

1.4 细胞培养

CNE-2细胞于37℃、5%CO2、相对饱和湿度条件下，在含10%小牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中传代培养，试验所选用细胞均处于对数生长期。

1.5 肿瘤细胞的生长抑制率测定（MTT法）

调整细胞浓度为105个/mL，接种于96孔板，每孔加入100 μL，轻轻混匀，置二氧化碳孵箱中培养24 h，细胞覆盖率为70%左右。光照组和避光组，分别加入终浓度为 0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 μg/mL的金丝桃素，设只加溶剂DMSO的空白对照和血卟啉阳性对照组，阳性对照组加入终浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μg/mL 的血卟啉。避光培养6 h后，将黄光LED光源置于金丝桃素光照组正上方2 cm处，红光LED光源置于阳性对照组正上方2 cm处，用光纤功率计调整光源功率密度为1.05 mW/cm2，照射90 min，积累能量约5.67 J/cm2后继续培养20 h，吸去培养液，PBS（pH7.4）漂洗1次，加入100 μL终浓度为0.5 mg/mL的MTT无血清培养基，继续避光培养4 h，小心吸去培养液，加入DMSO∶无水乙醇为1∶1的混和液100 μL溶解甲臜，振荡15 min，用Spectramax M2光密度荧光检测仪（波长570 nm）测定各孔吸光值A570，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（Inhibition Rate，IR）% =（1－实验组A570平均值/对照组A570平均值）×100。Bliss方法［3］计算半数抑制浓度IC50。

1.6 细胞周期检测

将对数生长期的人鼻咽癌细胞株CNE-2于二氧化碳孵箱中培养24 h，分设0.20 μg/mL金丝桃素光照组、0.20 μg/mL金丝桃素不光照组和不加药不光照三个组，避光培养6 h，将黄光LED光源置于培养孔正上方2 cm处，照射90 min，积累能量约5.67 J/cm2后继续培养20 h，吸去培养液，PBS漂洗1次，胰酶消化，300 g离心5 min，PBS漂洗1次，离心后收集细胞，按Cycle TESTTMPLUS DNA Reagent Kit说明书处理细胞，FACSCalibur流式细胞仪检测细胞周期。

1.7 细胞凋亡检测

分别收集0.20 μg/mL金丝桃素作用下培养18、28、48 h的加药光照、加药不光照组细胞，按Apo-BRDUTMKit说明书处理样品，FACSCalibur流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.8 统计分析

实验数据采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，各组间均数采用t检验，结果以±s表示。

2 结果

2.1 金丝桃素对CNE-2细胞的毒作用

光照条件下，不同浓度的金丝桃素对CNE-2细胞的生长抑制率与空白对照组比较有极显著差异（P<0.01）。当金丝桃素的浓度为0.16 μg/mL时，对CNE-2细胞的生长抑制率达到90%以上，再增加金丝桃素浓度，抑制率无明显升高，结果见表1。避光条件下，单纯给予金丝桃素，对CNE-2细胞生长有一定的抑制作用，结果见表2，但相同浓度下，光照组与避光组间存在极显著差异（P<0.01），金丝桃素光照给药组呈明显的剂量依赖性，避光组的细胞抑制率明显低于光照组，见图1。光照条件下，金丝桃素对CNE-2细胞的 IC50为0.049 μg/mL，血卟啉对CNE-2细胞生长也有明显的抑制作用（P<0.01），见表 3，但其 IC50为 0.650 μg/mL，明显高于金丝桃素。

表1 光照条件下金丝桃素对CNE-2细胞的生长抑制作用（±s，n=8）

表1 光照条件下金丝桃素对CNE-2细胞的生长抑制作用（±s，n=8）

注：与对照组比较，*P<0.01。

组别 HY浓度/（μg/mL） A570 0.932±0.029 0金丝桃素 0.04 0.536±0.021 42.5*0.08 0.286±0.023 69.4*0.12 0.146±0.010 84.4*0.16 0.089±0.011 90.4*0.20 0.062±0.012 93.3 IR/%对照*

表2 避光条件下金丝桃素对CNE-2的生长抑制作用（¯x ± s，n=10）

图1 HY对CNE-2的生长抑制作用

表3 光照条件下血卟啉对CNE-2的生长抑制作用（¯x ±s，n=6）

2.2 金丝桃素对细胞周期的影响

流式细胞仪测定结果表明加药光照组G1期细胞比率较加药不光照组和不加药不光照组明显降低，S期和G2期的比率明显升高。见表4和图2。

表4 金丝桃素对CNE-2细胞周期的影响

2.3 金丝桃素对细胞凋亡的影响

流式细胞仪分析结果表明，加药不光照的细胞只出现少量凋亡细胞，随着加药孵育时间的延长，凋亡率逐渐增大，到48 h达到22.37%；而加药光照组在28 h时凋亡率已可达72.19%，延长至48 h可达92.24%，明显高于非光照组，见表5和图3。

图2 金丝桃素对CNE-2细胞周期的影响图

图3 金丝桃素对CNE-2细胞凋亡的影响

表5 金丝桃素对CNE-2细胞凋亡的影响

3 讨论

MTT法是用于检测细胞生长和细胞毒作用的可靠方法之一，不仅可以发现有效的抗肿瘤药物，还可以为细胞水平和分子水平的抗肿瘤作用机制研究提供可靠的实验数据［4］。本文通过MTT法检测观察到光诱导金丝桃素呈剂量依赖性抑制体外培养CNE-2细胞的增殖。

血卟啉的主要副作用为光过敏，在体内潴留长达4周左右，此间患者须避免光照，较高浓度血卟啉可加重光过敏反应。从上述试验结果可知，血卟啉的IC50值为0.650 μg/mL，是金丝桃素IC50值0.049 μg/mL的13倍多，金丝桃素用药后避光时间短，药物作用浓度低，副作用较血卟啉小，是一种较理想的光敏剂。

细胞周期中，S期是DNA合成期，G1和G2期为DNA合成前、后间期，无DNA的合成，但有RNA和蛋白质的合成。当DNA碱基受损时，细胞阻滞在G1期；当DNA双链断裂时，细胞被阻滞在G2期。若在DNA复制不完全时，则M期激活因子活化抑制，在S期阻断细胞周期［5］。大量研究表明：S期是化疗药物敏感时期，药物可以通过影响DNA合成中所需的酶，或直接作用于DNA单链模板的活性部位，抑制DNA合成，将细胞阻滞于S期，从而抑制肿瘤细胞的生长。本实验通过流式细胞仪分析发现金丝桃素光照组处理的细胞与其他两组对照比较，其S期和G2细胞比例明显升高，作用机制可能与影响DNA的合成及复制有关。

随着细胞凋亡分子机制研究不断深入，人们发现细胞凋亡信号通路主要有两条［6-7］：即细胞凋亡的线粒体依赖性途径和死亡受体途径。有研究表明线粒体不仅是新型光敏剂金丝桃素优先定位的靶标，也是光动力损伤最先打击的靶点［8］，它作用于细胞线粒体，使线粒体释放细胞色素C，使细胞内的DNA片段和细胞的形态发生变化［9-10］。上世纪90年代初，国内外学者发现有些细胞的凋亡存在特异性，表现为不同因素诱导的凋亡发生在细胞周期的不同时相［11］。这类细胞凋亡，往往是细胞先被阻滞在细胞周期的某一时相，再发生细胞凋亡。本文通过流式细胞仪分析，结果表明金丝桃素光照组的凋亡率随时间延长而明显增大，给药28 h达72.19%，48 h达92.24%，明显高于金丝桃素非光照组，说明金丝桃素光照后，其对CNE-2细胞的生长抑制作用明显增加。这与以往文献报道金丝桃素无论在黑暗或光照条件下，都具有抑制肿瘤细胞生物活性作用相符［12］，只是单独应用时需要高剂量金丝桃素。许川山等［13］用石英卤素灯作为光源，在590 nm波长条件下进行CNE-2细胞的凋亡研究，也得到凋亡率为53.08%的类似结果。

LED是近年来使用的一种新型光源，亮度高、功率小、寿命长，可组装成各种几何形状，有着普通光源不可比拟的优点。目前开发的LED光谱峰的半宽最窄已可达十几纳米以下，可供选择的波长范围覆盖整个可见光区，能满足不同的波长需求，其发光强度也完全可以满足一般的临床低强度治疗需要。因此，无论在波长、实用性和价格方面，LED都不逊色于激光器甚至更有优势［14］。国外已有人将LED光源应用于肿瘤的PDT研究，如美国的研究人员用LED光源进行脑肿瘤光动力治疗的临床试验已取得了良好效果［15］，所用光源的机械性能比激光和其他光源更为可靠。可见，用LED光源代替激光器进行生命科学研究具有广阔的应用前景。本文以金丝桃素为光敏剂，以LED作为PDT光源，试验结果表明光诱导金丝桃素对体外培养的鼻咽癌细胞CNE-2有明显抑制和诱导凋亡的作用，为鼻咽癌的体内研究和临床治疗提供了理论依据。

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Photocytotoxic and apoptosis of hypericin-mediated on nasopharyngeal carcinoma cell line of human in vitro

WANG Xiao-li1， WANG Cai-hong1，2， GUO Yi3， WANG Jin-lin1， ZHANG Jun-song1*
（1.Shenzhen Polytechnic，Shenzhen 518055，China；2.South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；3.Fudan University，Shanghai 200433，China）

hypericin；photodynamic therapy；light emitting diode；nasopharyngeal carcinoma；apoptosis

AIM：To study effects of hypericin associated with light emitting diode irradiation on nasopharyngeal carcinoma cell line of human in vitro.METHODS：CNE-2 cells were exposed respectively to different concentra-tion of hypericin，and compared with hematoporphyrin as positive control group，and incubated for 6 h in the dark，then accumulative radiated energe of yellow and red light irradiation equivalent to 5.67 J/cm2were given throughout 90 min，killing effect and apoptosis of CNE-2 cells were detected by MTT assay after incubation of 24 h and flow cytometry.RESULTS：MTT assay showed that cytotoxicity of hypericin and hematoporphyrin with light irradiation presented in dose-dependent way，their IC50values were 0.049 and 0.650 μg/mL，respectively.Flow cytometry showed that hypericin with light irradiation could block cell growth at S phase and G2phase，when CNE-2 cells were exposed to hypericin at 0.20 μg/mL for 18，28 and 48 h，the apoptosis rate reached at 9.97%，72.19%and 92.24%.CONCLUSION：Hypericin with light irradiation could obviously inhibit the growth of CNE-2 cells and induce apoptosis.

R285.6

A

1001-1528（2010）08-1296-05

2009-11-13

深圳市科技和信息局科技基金项目（06KJP038）

王晓利（1964－），女，教授，从事抗肿瘤药物及其机理研究。Tel：（0755）26019267

*通讯作者：张俊松，男，教授，Tel：（0755）26019366 E-mail：junsongzhang@yahoo.com.cn