可注射美洛昔康温敏凝胶的研制

陈敏燕，吴飞华，潘九英，金芝贵

（上海交通大学医学院附属第九人民医院药剂科，上海市 200011）

温敏性凝胶是一类温度响应型的智能凝胶材料，可以感知温度的变化而产生功能性的效应。温敏性凝胶材料由于具备原位凝胶的特性，被应用于药物传递[1]、组织工程、细胞生物学等领域。

美洛昔康通过选择性地抑制环氧合酶-2（COX-2）而阻止具有致炎作用的前列腺素等的合成，具有消炎、解热和镇痛的作用。临床主要用于类风湿性关节炎、疼痛性骨关节炎的治疗[2]，但腹痛和消化不良是其最常见的不良反应[3]。为了减轻美洛昔康带来的胃肠道刺激性，并减少给药次数和获得稳定的血药浓度，笔者以壳聚糖-甘油-硼砂为载体，研制了具有缓释性能的可注射美洛昔康温敏凝胶，用于关节腔注射给药，使其在作用部位直接且平稳地发挥药效，本文对该制剂的制备方法等介绍如下。

1 仪器与试药

TV1800紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；SYC智能恒温超级水槽（巩义市英谷予华仪器厂）；pHS-3C型pH计（上海雷磁仪器厂）；电子天平（上海天平仪器厂）。

壳聚糖（南通双林生物制品有限公司，Mr：95000，脱乙酰度：91.3%）；甘油（浙江遂昌甘油厂）；硼砂（自贡鸿鹤制药有限责任公司）；美洛昔康（南京长澳制药有限公司，批号：071208，含量：99%）；美洛昔康温敏凝胶（上海交通大学医学院附属第九人民医院，批号：080604、080610、080620，美洛昔康含量：0.035%）；其余试剂均为分析纯。

2 制备

2.1 空白凝胶的制备

壳聚糖用1%的醋酸溶解，制备成2%的溶液。加入一定量的甘油后，在搅拌条件下逐滴加入硼砂溶液，充分搅拌均匀使所得溶液的pH值为7.0。将该混合溶液放入37℃的恒温水浴中保持20 min，使体系胶凝充分，得到壳聚糖-甘油-硼砂水凝胶，该空白凝胶在室温下为可流动的液态，放置于37℃恒温水浴并保持20 min，得到均一的半固体状态，倒置装凝胶的西林瓶，凝胶不流动。室温及37℃条件下空白凝胶的形态详见图1。

图1 空白凝胶在不同条件下的形态A.室温；B.37 ℃Fig 1 Morphology of blank hydrogel at different conditionsA.at room temperature；B.at 37℃

2.2 美洛昔康温敏凝胶的制备

壳聚糖以1%的醋酸溶解，制备成2%的溶液。加入一定量甘油和美洛昔康药物溶液，室温搅拌条件下逐滴加入硼砂溶液，使所得溶液的pH值为7.0，充分搅拌使其混合均匀，放入37℃恒温水浴中使其胶凝完全。

3 影响因素考察

3.1 温度

按“2.1”项下方法制备壳聚糖-甘油-硼砂水凝胶，取未凝前样品5份，每份2 mL，分别加入5个长10 cm、直径1.4 cm的玻璃试管中，将试管分别放至于30℃、32℃、35℃、37℃、40℃的恒温水浴中，每半分钟取出观察凝胶形成情况，以试管倒置30 s内凝胶不流动为凝胶形成的标志[4]，重复试验3次，记录凝胶形成平均所需的时间。温度对凝胶形成的影响详见表1。

表1 温度对凝胶形成的影响Tab 1 Effect of temperature on formation of gel

表1结果表明，当环境温度低于32℃时，凝胶不能形成，呈溶液状；当环境温度高于32℃时，凝胶形成，呈半固体状，并且温度越高，胶凝时间越短；当环境温度为37℃时，凝胶从液态变成半固态只需3 min，表明本凝胶注射进入体内后能迅速胶凝，避免随体液流失。

3.2 pH值

取壳聚糖2%溶液，加入甘油制备7份。每一份在搅拌条件下逐滴加入硼砂溶液，分别调节凝胶体系pH值至6.2、6.5、6.7、6.9、7.0、7.1、7.2，充分搅拌使其混合均匀。观察凝胶形成情况以及胶凝时间，重复试验3次，记录凝胶形成平均所需的时间。pH值对凝胶形成的影响详见表2。

表2 pH值对凝胶形成的影响Tab 2 Effect of pH on formation of gel

表2结果表明，本凝胶在近中性的环境中形成（pH值范围为6.7～7.1）。pH值低于6.7的体系，凝胶不能形成，呈溶液状。pH值高于7.1的体系，随着硼砂的继续加入，凝胶体系即刻成沉淀。在pH 6.7～7.1范围内，随着体系pH的升高，胶凝所需时间越短。pH 6.7和pH 6.9的凝胶体系胶凝所需时间较长。pH 7.1的凝胶体系浊度较高，偶见丝状沉淀物，故本研究采用pH 7.0的凝胶体系。

3.3 甘油与壳聚糖比例

取壳聚糖2%溶液5份，每份分别加入不同量的甘油，使甘油与壳聚糖的比例分别为1∶10、1∶5、3∶10、2∶5、1∶2。并在搅拌条件下逐滴加入硼砂溶液，分别调节凝胶体系pH至7.0，充分搅拌使其混合均匀。观察凝胶形成情况以及胶凝时间，重复试验3次，记录凝胶形成平均所需时间。甘油比例对凝胶形成的影响详见表3。

表3 甘油与壳聚糖比例对凝胶形成的影响Tab 3 Effect of the ratio of glycerin to chitosan on formation of gel

表3结果表明，随着甘油比例的增加，调节凝胶体系至固定pH值所需要硼砂溶液的量就越多，凝胶体系中含水量越多，形成凝胶所需要的时间越长。甘油-壳聚糖比例在1∶10和1∶5时，凝胶形成的时间很短，但是未凝前体系太黏稠，不适于注射给药。甘油-壳聚糖比例在3∶10时，胶凝需时3 min，并且未凝前样品稠度适中，比较适合注射给药。甘油-壳聚糖比例在2∶5和1∶2时，凝胶形成所需的时间较长。

4 壳聚糖-甘油-硼砂温敏凝胶中美洛昔康体外释放度的考察

4.1 紫外分析方法的建立

4.1.1 测定波长的选择。称取10 mg的美洛昔康溶于100 mL的0.1 mol·L－1的NaOH中，经稀释制得10 mg·L－1的美洛昔康对照溶液，以0.1 mol·L－1的NaOH为空白对照，在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描，结果美洛昔康在364 nm波长处有最大吸收单峰，故确定364 nm为美洛昔康紫外检测波长。

4.1.2 标准曲线的制备。制备20.05 mg·L－1的美洛昔康母液，分别取1.0、2.0、3.5、4.0、5.0、6.0 mL置于10 mL的容量瓶中，定容，于364 nm波长处测定吸光度，以美洛昔康的吸光度（A）对浓度（C）作线性回归，得回归方程C＝17.052A+0.2387（r＝0.9994）。结果表明，美洛昔康检测浓度线性范围为2.005～12.030 mg·L－1。

4.1.3 精密度试验。精密吸取美洛昔康同一浓度对照溶液（10 mg·L－1）于364 nm波长处测定吸光度，重复进样5次。结果，峰面积均值RSD＝0.25%，表明仪器精密度良好。

4.1.4 回收率试验。精密吸取美洛昔康高、中、低3个浓度各2份的对照溶液，加入到按“2.1”项下方法制备的空白凝胶中，再加入0.1 mol·L－1的NaOH，搅拌使溶解，过滤，取续滤液用0.1 mol·L－1的NaOH定容，测定吸光度。结果，平均回收率为98.03%，RSD＝0.65%（n＝6）。

4.1.5 样品含量测定。精密称取3批美洛昔康温敏凝胶样品各2 g，按“4.1.4”项下的方法测定美洛昔康的含量。结果，3批样品中美洛昔康的标示含量分别为97.35%、96.89%、97.90%（n＝3），平均标示含量为97.38%。

4.2 体外释放度的测定

按“2.2”项下方法制备美洛昔康温敏凝胶未凝前的样品10 g（批号：080604、080610、080620），分别放入3个50 mL的圆底离心管中，于37℃恒温水浴中放置20 min使该体系胶凝充分，胶凝后在凝胶上部加15 mL、pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）作为释放介质（达到漏槽条件）。将装凝胶的离心管放入37 ℃、100 r·min－1的恒温摇床中，分别于1、3、5、7、10、24、48、96、144、192、240、288 h取5 mL释放样品，同时补加5 mL同温空白释放介质。用紫外分光光度法分析释放样品，计算其累积体外释放百分率。3批样品的体外释放曲线详见图2。

图2 3批样品体外释放曲线Fig 2 Release curves of 3 batches of samples in vitro

图2结果表明，3批样品48 h时平均累积释放百分率达56%，288 h时达76%。在288 h时取出凝胶样品，凝胶依然呈半固体状。

对3批样品的体外释放行为进行相似因子（f2）法[5]比较，f2的计算公式如下：

当f2值在50～100之间时，认为2种制剂的体外释药行为无显著性差异。在该公式中，Rt和Tt表示2个批号的制剂在t时间点的平均累积释放百分率，n为测试点数。批号080604和080610的f2值为58.4，批号080604和080620的f2值为51.4，批号080610和080620的f2值为69.4，表明3个批号的样品体外释药行为无显著性差异。

5 讨论

在288 h时取出凝胶样品观察，发现凝胶依然呈半固体状，与0 h相比，凝胶骨架结构更紧致了，具有一定的机械强度，这可能是后半段时间美洛昔康从凝胶中释放速度减慢的一个重要原因。

壳聚糖-甘油-硼砂温敏凝胶制备条件温和，符合环保要求。作为一种药物载体骨架系统，能够在一定程度上控制药物的被动扩散，即可作为注射植入性材料，也可用于腔道非注射性涂抹，是一种可注射的缓控释药物给药系统。本凝胶温度敏感性高，机械强度好，有望用于药物载体、生物组织工程等领域，具有广泛的应用前景。

本研究制备的美洛昔康温敏凝胶是可供关节腔注射的、具备缓释性能的新型药物制剂，为美洛昔康治疗风湿性关节炎、疼痛性骨关节炎提供了一种新的给药方式。

[1]Ruel-Gariepy E，Leroux JC.In situ-forming hydrogelsreview of temperature-sensitive systems[J].Eur J Pharm Biopharm，2004，58（2）：409.

[2]陈新谦，金有豫，汤 光主编.新编药物学[M].第15版.北京：人民卫生出版社，2004：195.

[3]王庆利，盛春元，赵桂宏.新型非甾体抗炎药COX-2选择性抑制剂的研究及应用进展[J].中国药房，2001，12（5）：305.

[4]Wu J，WeiW，Wang LY，et al.A thermosensitive hydrogel based on quaternized chitosan and poly（ethylene glycol） for nasal drug delivery systems[J].Biomaterials，2007，28（13）：2220.

[5]Jeffrey W，Henry H.Mathematical comparison of dissolution profiles[J].Pharm Tech，1996，20（6）：64.