白介素-4和免疫球蛋白E含量指标在快速检测药物引起过敏反应中的作用研究Δ

肖贵南，盛英美，陈浩桉，李建定

（1.广东省药品检验所，广州市 510180；2.中山大学中山医学院，广州市 510089）

药物注射剂引起的过敏反应呈逐年增加的趋势，而其检测方法主要参照2005年版《中国药典》规定的豚鼠过敏反应检查法，存在检验周期偏长（2～3周）、直接观察过敏反应指标（竖毛、咳嗽、喷嚏等）不够客观等缺陷[1]。本文以经过常规过敏反应检查法证实能引起过敏的中药注射剂及生化制剂为例，通过建立连续静脉注射致敏方法，探讨检测血清中白介素-4（IL-4）和免疫球蛋白E（IgE）抗体在快速判断药物引起的过敏反应中的可行性，并与常规法定方法进行比较，为药物引起的过敏反应提供一种新型的快速检测途径。

1 材料

1.1 试药

清开灵注射液（吉林某药厂生产，批号：090118-6，规格：每支10 mL）；香丹注射液（浙江某药厂生产，批号：080524，规格：每支10 mL）；脑蛋白水解物注射液（吉林某药厂生产，批号：081201，规格：每支5 mL）；喘可治注射液（广州健心药业有限公司生产，批号：20071102，规格：每支2 mL）；马血清（广州蕊特生物科技有限公司生产，批号：090318，规格：每瓶100 mL）；生理盐水（昆明市宇斯药业有限公司生产，批号：08070204，含量：9 g·L－1，规格：每瓶100 mL）；IL-4和总IgE测定试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）。

1.2 动物

Hartery品系的豚鼠，♀♂各半，体质量：280～320 g，购自广东省医学实验动物中心，合格证号：2008A0026。

1.3 仪器

Elx808酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

2 方法

2.1 马血清引起IL-4和总IgE水平升高及过敏反应的时效性

取豚鼠32只，按攻击时间不同分为4组（d 7、d 8、d 9、d 10攻击组），每组8只，♀♂各半，各组豚鼠均分别于d 0、d 1、d 2静脉注射10%马血清0.5 mL进行致敏，共注射3次，分别对应于d 7、d 8、d 9、d 10各组取全部豚鼠8只，从豚鼠足背中静脉取血1 mL，3000 r·min－1离心15 min，分离血清测定IL-4和总IgE。取血后的各只豚鼠再从阴茎背静脉注射1次马血清1.0 mL进行攻击，观察并记录豚鼠整体过敏反应的发生情况。另取未经任何处理的豚鼠8只作为空白组，取静脉血离心分离血清，以酶联免疫吸附（ELISA）法测定空白IL-4和总IgE。

2.2 静脉注射药物引起IL-4和总IgE水平升高及过敏反应的快速检查

取豚鼠40只，♀♂各半，随机分为5组：生理盐水组、清开灵注射液组、香丹注射液组、脑蛋白水解物注射液组、喘可治注射液组，每组8只，♀♂各半，各组豚鼠分别于d 0、d 1、d 2静脉注射上述供试品原液0.5 mL，每只豚鼠共注射3次进行致敏，并于d 8从豚鼠足背中静脉取血1 mL，分离血清，测定IL-4和总IgE。再从阴茎背静脉注射相应供试液1.0 mL进行攻击，观察并记录豚鼠整体过敏反应的发生情况。

2.3 药物腹腔注射过敏反应检查方法及IL-4和总IgE水平的测定

取豚鼠随机分为6组：生理盐水组、马血清组、清开灵注射液组、香丹注射液组、脑蛋白水解物注射液组、喘可治注射液组，每组12只，马血清浓度为10%，各组豚鼠分别于d 0、d 2、d 4腹腔注射相应供试液0.5 mL进行致敏。于d 14、d 21时，每组分别各取6只豚鼠从足背中静脉取全血1 mL，分离血清测定IL-4和总IgE水平。取血后的各组6只豚鼠再从阴茎背静脉注射相应供试液1.0 mL进行攻击，观察并记录豚鼠整体过敏反应的发生情况。

2.4 ELISA法测定血清IL-4和总IgE水平

血清存放于－30℃冰箱中，1月内进行IL-4和总IgE水平的测定；采用双抗夹心ELISA法，严格按试剂盒说明书进行操作。

2.5 豚鼠过敏反应的判断

参照2005年版《中国药典》附录的标准，观察豚鼠注射供试液进行攻击后30 min内有无喷嚏、抽搐、休克等过敏反应发生。如豚鼠发生竖毛、喷嚏、干呕、连续咳嗽3声和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现抽搐、休克、死亡现象之一者，判为过敏反应阳性。

2.6 数据处理与统计

3 结果

3.1 马血清引起IL-4和总IgE水平升高及过敏反应的时效性

豚鼠整体实验情况：连续3 d静脉注射致敏后，d 7攻击的8只豚鼠中有5只出现过敏反应阳性结果（3只死亡），d 8及以后各组8只豚鼠均在攻击后5 min内出现过敏反应阳性结果（每组有4只豚鼠死亡）。

空白组豚鼠血清的IL-4和总IgE水平分别为（92.4±11.8）ng·L－1（n＝8）、（43.3±6.3）IU·mL－1（n＝8）。血清中IL-4和总IgE水平结果见表1。

表1 马血清引起IL-4和总IgE水平升高的时效性实验结果（±s，n＝8）Tab 1 The time-effectiveness of the increase of IL-4 and IgE caused by horse serum（±s，n＝8）

表1 马血清引起IL-4和总IgE水平升高的时效性实验结果（±s，n＝8）Tab 1 The time-effectiveness of the increase of IL-4 and IgE caused by horse serum（±s，n＝8）

与空白组相应的指标比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.relevant index of blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

由表1可见，注射马血清进行致敏后，豚鼠血清IL-4和总IgE水平在d 7时开始升高（P＜0.05），d 8起出现急剧升高（P＜0.01），与空白组的相应指标相比，均有显著性差异。

上述整体实验及ELISA法测定结果提示：连续3 d静脉致敏后的d 8起，豚鼠可出现明显的过敏反应和IL-4及总IgE水平升高，因而以下静脉致敏的过敏反应检查均以d 8为准，以此反映过敏反应的出现时间。

3.2 静脉注射药物引起IL-4和总IgE水平升高及过敏反应的快速检查

豚鼠整体实验情况：静脉致敏d 8后，除了生理盐水组和喘可治注射液组豚鼠未出现过敏反应外，其余各组8只豚鼠均出现了过敏反应阳性结果。

血清中IL-4和总IgE水平测定结果见表2。

表2 静脉注射致敏药物d 8时各组豚鼠血清中IL-4和总IgE水平（±s，n＝8）Tab 2 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 8 days after intravenous administration of allergic agents（±s，n＝8）

表2 静脉注射致敏药物d 8时各组豚鼠血清中IL-4和总IgE水平（±s，n＝8）Tab 2 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 8 days after intravenous administration of allergic agents（±s，n＝8）

与生理盐水组相应的指标比较：＊P＜0.01，#P＜0.01vs.relevant index of normal saline group：＊P＜0.01，#P＜0.01

表2结果显示，静脉注射致敏后d 8，与生理盐水组比较，喘可治注射液组豚鼠血清IL-4和总IgE水平维持在正常水平（P＞0.05），其余各组豚鼠血清IL-4和总IgE水平均升高（P＜0.01）。静脉致敏后，豚鼠整体出现过敏反应的时间（d 8）与攻击前豚鼠血清IL-4和总IgE水平升高时间（d 8）相平行。

3.3 药物腹腔注射过敏反应检查方法及IL-4和总IgE水平测定

豚鼠整体实验情况：各组豚鼠隔日腹腔注射药物致敏后，在d 14和d 21，以同种供试液进行攻击，生理盐水组和喘可治注射液组豚鼠未出现过敏反应，其余各组豚鼠均在攻击后出现了过敏反应，马血清组还有4只豚鼠死亡。

IL-4和总IgE水平测定结果见表3。

表3 腹腔注射致敏药物d 14、d 21时各组豚鼠血清中IL-4及总IgE水平（±s，n＝6）Tab 3 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 14 days and 21 days after intraperitoneous administration of allergic agents（±s，n＝6）

表3 腹腔注射致敏药物d 14、d 21时各组豚鼠血清中IL-4及总IgE水平（±s，n＝6）Tab 3 Serum level of IL-4 and IgE of guinea pigs 14 days and 21 days after intraperitoneous administration of allergic agents（±s，n＝6）

与生理盐水组相应的指标比较：＊P＜0.01，#P＜0.01vs.relevant index of normal saline group：＊P＜0.01，#P＜0.01

表3结果表明，常规方法致敏后d 14和d 21，与生理盐水组相比，喘可治注射液组豚鼠血清IL-4和总IgE水平维持在正常（P＞0.05），其余各组豚鼠血清IL-4和总IgE水平均升高（P＜0.01），与表1、表2的静脉注射致敏结果一致。

4 讨论

药物引起的过敏反应以速发型过敏反应最为常见、危害也最大，现有判断药物引起过敏反应的方法主要有直接检测过敏物质、被动皮肤过敏反应实验、豚鼠回肠条实验、豚鼠主动过敏反应检查法等[2，3]，上述动物实验方法存在检验周期偏长、过敏反应观察指标不够客观等缺陷，不利于迅速得出结论。

IgE抗体在速发型过敏反应发病机制中的作用己成定论，而IL-4是辅助T细胞衍生的一类细胞因子，是促进IgE合成的最主要细胞因子，过敏原进入机体后引起IL-4和IgE升高并可保持较长时间，使机体始终处于一个高敏状态，再次遇到同一过敏原时可导致机体产生过敏反应[4]，因而提供了一个可供快速检测药物引起过敏反应的新思路。

本文对近2年广东省药品检验所承担的上述4个国家药品评价抽验品种进行了过敏反应的对比检查研究。对传统的隔日腹腔注射致敏法的给药途径和间隔周期进行了改进，采用连续3 d静脉注射致敏法，证明在静脉致敏的d 8，阳性药物攻击前豚鼠血清IL-4和总IgE水平明显升高，最终结果与传统的腹腔致敏法一样，均可有效判断药物引起的过敏反应，且比传统方法判断过敏反应的时间提早1～2周。

本研究结果提示，血清IL-4和总IgE水平可望成为早期检测药物引起的过敏反应的灵敏指标，它反映了药物静脉注射致敏豚鼠后d 8就出现的过敏反应，避免了常规方法所存在的缺陷，符合新版《中国药典》关于进一步加强药物过敏反应检查方法的研究方向，具有较好的应用价值。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：附录101.

[2]胡昌勤，许明哲，马 越，等.含丹参的中药注射液中过敏性杂质的检测[J].药学学报，2008，43（5）：518.

[3]Pullerits T.Cytokine modulation for anti-allergic treatment[J].Curr Pharm Des，2002，8（20）：1845.

[4]Bettiol J，Sele J，Henket M，et al.Cytokine production from sputum cells after allergenic challenge in IgE-mediated asthma[J].Allergy，2002，57（12）：1145.