HPLC法测定自发性高血压大鼠血浆中去甲肾上腺素的含量Δ

梁秋云，黄慧学，刘华钢，蒙华琳

（1.广西医科大学，南宁市 530021；2.广西中医学院，南宁市 530021；3.广西柳州医学高等专科学校，柳州市 545006）

去甲肾上腺素（NA）是重要的单胺类递质，测定其血浆浓度可为高血压、帕金森氏病、甲亢、嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤等诊断定位提供依据[1]。国内、外测定血浆中NA含量报道的方法主要有高效液相色谱（HPLC）-电化学检测法、HPLC-荧光法及毛细管电泳法等[1～3]，但大部分方法的样品处理较复杂，对仪器设备的要求较高或灵敏度低；紫外检测器是HPLC最常配备的检测器，应用范围广，目前还未见采用HPLC-紫外检测（UV）法测定血浆中NA的报道。本实验以可能具有高血压治疗作用的多糖为模拟药物，同时设立阳性对照药卡托普利片，建立HPLC-UV法测定自发性高血压大鼠（SHR）血浆中NA含量的方法，为临床诊断和基础研究提供一种快速、简便、准确测定血浆中NA的含量测定方法。

1 材料

HPLC仪，包括2487紫外可见检测器、柱温箱、Breeze3.3工作站（美国沃特斯公司）；C18色谱柱（大连依利特分析仪器有限公司）；TGL-16C高速微量离心机（上海安亭科学仪器厂）；751型紫分光光度计（上海分析仪器总厂）。

仙人掌果采于广西北海涠洲岛，经广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为仙人掌Opuntia dillenii（Ker.-Gawl.）Haw.植物的果实。仙人掌果多糖（CPFP）由上述仙人掌果经本课题项目组提取、纯化制得（多糖含量大于70%）；NA对照品（瑞士Fluka公司，批号：2002298，纯度：≥98%）；阳性对照药卡托普利片（汕头金石制药总厂，批号：070311，规格：每片25 mg）；甲醇为色谱纯，水为去离子重蒸水，其余试剂均为分析纯。

SHR，♂，12周龄，体质量（220±50）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK（沪）2003-0003；同龄♂Wistar大鼠由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK桂2003-0003。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：C18（250 mm×4.0 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.15 mol·L－1磷酸二氢钾缓冲液（1∶9，V/V，pH＝6.0）；柱温：室温；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：280 nm。

2.2 给药、分组及血样处理

SHR随机分为5组：CPFP高、中、低剂量组和阳性对照药组、模型组，每组10只，另取正常血压的Wistar大鼠10只为正常对照组。CPFP高、中、低剂量组分别ig 2.37、1.58、0.76 g·kg－1·d－1（剂量由预试验确定）CPFP；阳性对照药组ig 10 mg·kg－1·d－1（剂量由临床给药剂量确定）卡托普利，正常对照组及模型组ig无菌注射用水，各组大鼠每天给药1次，连续9周。9周末自腹主动脉取血，血样收集于1.5 mL肝素离心管中，及时于4 ℃、2000 r·min－1离心，取血浆100 μL，加0.05 mol·L－1高氯酸200 μL，10000 r·min－1离心2 min，取上清液置于－20 ℃冰箱中待测。

2.3 方法专属性

取阴性溶液（流动相）、0.05 mol·L－1高氯酸溶解的NA对照品溶液和给药9周后的血浆样品处理溶液进样，色谱见图1。

图1 SHR血浆样品中NA的HPLC色谱图A.阴性溶液；B.对照品；C.血浆样品；1.NAFig 1 HPLC chromatograms of NAin plasma of SHRA.negative solution；B.standard substance；C.plasma sample；1.NA

在选定的色谱条件下，NA峰形良好，分离完全，其保留时间为3.05 min；以NA计算理论塔板数不小于3000；其它内源性物质基本不干扰测定。

2.4 线性范围和最低检测限

取干燥至恒重的NA对照品适量，精密称定，用0.05 mol·L－1高氯酸溶解并分别稀释成0.5 g·L－1的对照品贮备液。

精密吸取贮备液1、20、40、60、80 μL，分别稀释为0.5、10、20、30、40 µg·L－1，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程为Y＝271906X－14910（r＝0.9999）。以3倍信噪比计算出NA检测限为0.05µg·L－1。

2.5 精密度及稳定性试验

取“2.2”项下其中1份血样，分别于同日内重复测定5次，求得日内精密度；每日2次，重复测5 d，求得日间精密度。结果，日内精密度的RSD＝2.15%，日间精密度的RSD＝3.81%，表明仪器精密度良好。

将已知NA浓度的血样置于－20℃下存放，于1、3、5、7 d再测试其含量，考察样品放置稳定性。结果RSD＝2.08%，表明血浆中NA在－20℃下至少能稳定7 d。

2.6 回收率试验

因NA为内源性物质，故用加入法测定回收率，即通过向已知浓度的样本提取液中加入一定量的NA贮备液，按“2.1”色谱条件进行测定，扣除样品中原有的含量，求出NA的加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝5）Tab 1 Results of recovery test（n＝5）

2.7 血浆样品中NA的含量测定

取各组血样按上述色谱条件进样分析，各组NA含量结果详见表2。

表2 各组血样中NA含量测定结果（±s，n＝10）Tab 2 Content determination of NA in plasma of SHR of each group（ ±s，n＝10）

表2 各组血样中NA含量测定结果（±s，n＝10）Tab 2 Content determination of NA in plasma of SHR of each group（ ±s，n＝10）

与模型组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

NA含量/μg·L－1 8.89±1.5618.03±1.8714.15±2.09＊＊16.31±1.64＊17.27±2.1511.45±2.30＊＊组别正常对照组模型组CPFP高剂量组CPFP中剂量组CPFP低剂量组阳性对照药组

由表2可知，所建立方法不但能测定各组大鼠中NA含量，同时还表明给药9周后，与模型组比较，CPFP高剂量组、阳性对照药组NA含量显著降低（P＜0.05），提示所建立的NA含量测定方法可用于高血压治疗药物的药动学研究。

3 讨论

样品处理方法的选择对测定血样中微量NA含量十分重要。文献报道[1～3]的血样的处理方法中多以氧化铝吸附法或溶剂萃取法进行提取，成本较高，步骤烦琐。本实验直接采用0.05 mol·L－1高氯酸处理样品，与其他提取法相比，操作简便、快速，且回收率高。

NA属碱性化合物，而酸性条件下碱性物质出峰时间将缩短，碱性条件下碱性物质出峰时间会延长[4]，因此选择适宜pH值的流动相十分重要。本实验前期对不同pH值的磷酸盐缓冲液进行考察后，发现流动相的pH值在6.0左右最有利于样品的检测和分离。

本实验前期对NA进行紫外波长下扫描，发现NA在280 nm波长处有最大吸收峰，故选择280 nm作为检测波长。

综上所述，本方法线性、精密度、回收率良好，灵敏度高，操作简便，可用于NA的药动学及相关研究。

[1]吴燕川，冯秀丽，何士大，等.样品固相萃取及高效液相色谱法测定血浆中去甲肾上腺素[J].首都医科大学学报，2005，26（6）：760.

[2]郑春梅，张惠云.大鼠血清中单胺类递质的高效液相色谱-荧光检测法分析[J].药物分析杂志，2006，26（2）：215.

[3]付 敏，张东朋，马万云，等.多巴胺和5-羟色胺的毛细管电泳测定[J].分析测试学报，2002，21（2）：1.

[4]谢笑龙，杨郸莉，李志梅，等.血浆儿茶酚胺的同时提取及反向高效液相测定法[J].遵义医学院学报，2005，28（4）：324.