古抑菌素A诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及对脆性组氨酸三联体蛋白和凋亡相关蛋白表达的影响Δ

王丽，宋杰，刘晓燕，何涛，段承刚

（泸州医学院医学分子生物学实验室，泸州市 646000）

肝癌是威胁人类生命健康的消化道肿瘤之一，世界卫生组织调查数据显示，全世界每年新发现的肝癌患者中约42.5%发生在我国，且发病率和死亡率仍在不断上升，寻找有效的治疗药物和辅助治疗手段乃当务之急。研究[1，2]发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitor，HDACi）可纠正肿瘤细胞异常的乙酰化状态，引起细胞周期的阻断和肿瘤细胞选择性凋亡，具有潜在抗肿瘤作用。目前HDACi中氧肟酸盐类的Suberoylanilide hydroxamic acid（SAHA）、Depsipeptide（FK228）、MS-275（N，N-2-氨基苯基-氨甲基-苄基-3-氨基酸-吡啶甲基酯）和N-acetyldinaline（CI-994）等已经进入Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，有望作为非细胞毒性新型肿瘤靶向治疗药物而应用于多种恶性肿瘤的治疗。氧肟酸类的古抑菌素A（Trichostatin A，TSA）属于一种特异性的HDACi，其在纳摩尔级浓度便具有较高活性[3]。本研究借助体外培养技术，将不同浓度的TSA作用于人肝癌HepG2细胞，测定其抑制率和凋亡率，并应用免疫细胞化学技术研究TSA对脆性组氨酸三联体（Fragile histidine triad，FHIT）蛋白和凋亡相关蛋白caspase-3、bax、bcl-2表达的影响，为进一步探讨TSA抑瘤作用机制提供试验依据。

1 材料

1.1 仪器

倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；ELX800酶标仪（美国Bio-Tek公司）；5417高速低温离心机（德国Eppendorf公司）；Tannon2500凝胶图像扫描系统（美国BIO-RAD公司）。

1.2 细胞与试药

人肝癌细胞株HepG2（本实验室保存）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；新生小牛血清（成都市华星生物化学制品厂）；二甲基亚砜（DMSO）、TSA（用 DMSO制备成浓度为1 μmol·L－1的贮存液）、MTT（美国Sigma公司）；FHIT兔抗人多克隆抗体（美国Bioworld Technology公司）；β-actin兔抗人多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；脱氧核苷酸末端转移酶介导的dTP缺口末端标记技术（TUNEL法）凋亡检测试剂盒、SABC免疫组化染色试剂盒、3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒、兔抗人的caspase-3、bax以及bcl-2多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（H+L）购自中杉金桥公司；其它所用试剂均为国产或进口分析纯。

2 方法

2.1 细胞培养

将HepG2接种于含10%胎牛血清及青霉素、链霉素各100 IU·mL－1的高糖DMEM培养液中，于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长后每2天换液1次，生长密度达80%时用0.25 g·L－1的胰酶消化传代。

2.2 MTT法检测细胞增殖程度

取对数生长期的HepG2细胞经胰酶消化后计数，调整细胞密度为每毫升1×105个，接种于96孔板，每孔100 μL。待细胞贴壁后设为不同浓度TSA药物组（125、250、500、1000、2000 nmol·L－1）、对照组（加入等体积的纯DMSO）以及空白组（只加培养基不加细胞，MTT测定时用于调零），每组6复孔，分别培养24、48 h后，每孔加入5 g·L－1MTT 20 μL，继续孵育4 h终止培养，小心吸弃培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，酶联免疫检测仪上以490 nm为检测波长测量各孔的吸光度值（A），按公式：细胞抑制率＝[1－（药物组吸光值/对照组吸光值）]×100%，计算各组细胞抑制率。

2.3 Tunel法检测肝癌HepG2细胞的凋亡率

根据MTT法检测结果，选择与对照组相比差异具有统计学意义的250 nmol·L－1、1000 nmol·L－1浓度的TSA分别作为后续试验低、高浓度TSA的代表。取指数生长期的HepG2细胞以每毫升5×105个接种于预先放有消毒盖玻片的12孔板内制备细胞爬片，待细胞密度达90%时随机分为2组：对照组和不同浓度TSA组，每组设3个复孔。24 h后取出细胞爬片，丙酮固定后按TUNEL法试剂盒操作说明书进行检测，最后DAB试剂盒染色后细胞核呈棕褐色的为凋亡细胞，每张片随机取5个高倍视野，运用Image Pro Plus（IPP）软件分析，按公式计算细胞凋亡率：TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

2.4 免疫细胞化学法检测FHIT蛋白和凋亡相关蛋白的表达

将细胞爬片取出，丙酮固定后按照免疫组化试剂盒说明书进行FHIT、caspase-3、bcl-2、bax的免疫组化染色。每个指标选取3张片子，每张片取5个高倍视野，运用Image Pro Plus（IPP）软件分析FHIT、caspase-3、bcl-2、bax蛋白表达的累积光密度值（Integrated optical density，IOD）。IOD值越大，表明FHIT蛋白和凋亡相关蛋白的表达量越高。

2.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件，方差齐性检验后对多组间的比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用S-N-K法或Dunnett法，实验数据以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 TSA对HepG2细胞增殖的影响

MTT法检测细胞增殖情况结果见表1。

由表1可见，与对照组比较，不同浓度TSA均能抑制肝癌细胞HepG2的增殖，并随作用浓度的升高及作用时间的延长而抑制作用增强（P＜0.05），具有药物浓度与时间依赖性。

3.2 HepG2细胞的凋亡率

TUNEL染色结果显示，凋亡细胞的细胞核呈棕褐色着色，多伴有核染色质高度凝聚、边缘化；核碎裂、核固缩，产生凋亡小体，TSA组内的TUNEL阳性细胞率明显高于对照组。对照组与250、1000 nmol·L－1TSA组作用24 h的细胞凋亡率分别为（1.57±0.26）%、（26.81±1.53）%、（35.44±2.66）%，组间细胞凋亡率比较具有显著性差异（F＝587.71，P＜0.01）。

表1 不同浓度TSA作用后人肝癌HepG2细胞增殖情况的MTT法检测结果（±s，n＝6）Tab 1 Results of MTT assay for the proliferation of hepatoma HepG2 cell treated with different concentrations of TSA（±s，n＝6）

表1 不同浓度TSA作用后人肝癌HepG2细胞增殖情况的MTT法检测结果（±s，n＝6）Tab 1 Results of MTT assay for the proliferation of hepatoma HepG2 cell treated with different concentrations of TSA（±s，n＝6）

与对照组比较：＊P＜0.01；与24 h比较：△P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.at 24 h：△P＜0.01

组别对照组TSA 125 nmol·L－1 TSA 250 nmol·L－1 TSA 500 nmol·L－1 TSA 1000 nmol·L－1 TSA 2000 nmol·L－1 24 h 48 h抑制率/%－6.8112.50＊12.64＊18.18＊21.59＊13.99＜0.01 F P吸光度值0.89±0.030.85±0.040.82±0.04＊0.76±0.06＊0.76±0.02＊0.74±0.02＊17.70＜0.01抑制率/%－4.497.8714.61＊14.67＊16.85＊11.57＜0.01吸光度值0.88±0.040.82±0.040.77±0.02＊0.76±0.01＊0.72±0.02＊△0.69±0.02＊△15.63＜0.01

3.3 HepG2细胞中FHIT与凋亡相关蛋白免疫细胞化学染色结果

免疫细胞化学染色结果显示，FHIT在HepG2细胞中的阳性表达呈棕黄色，凋亡相关蛋白在HepG2细胞中的阳性表达呈紫蓝色。与对照组比较，加入TSA作用24 h后，胞质的棕黄色细颗粒明显增加，表明FHIT蛋白的表达量升高，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.01）；caspase-3、bax的紫蓝色着色随TSA浓度的增加而逐渐加深，表明caspase-3、bax蛋白的表达出现增强，与对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05），而bcl-2的变化各组间比较差异不明显。各组结果详见表2。

表2 各组FHIT、caspase-3、bax、bcl-2蛋白表达的定量分析结果（±s，n＝15）Tab 2 Quantitative analysis of the protein expression of FHIT，caspase-3，bax and bcl-2（±s，n＝15）

表2 各组FHIT、caspase-3、bax、bcl-2蛋白表达的定量分析结果（±s，n＝15）Tab 2 Quantitative analysis of the protein expression of FHIT，caspase-3，bax and bcl-2（±s，n＝15）

与对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

TSA浓度/nmol·L－1 0（对照）2501000 IOD F P bcl-235898.26±3187.5937118.77±3576.4739445.08±1490.591.94＞0.05 FHIT 12346.36±4436.3137118.77±3576.47＊＊158884.63±28605.07＊＊43.60＜0.01 caspase-337950.34±3016.91105175.80±13343.62＊＊122314.50±11301.53＊＊94.72＜0.01 bax 70182.68±6510.72129870.70±42714.72＊152150.17±17612.56＊＊14.85＜0.01

4 讨论

TSA作为一种特异的HDACi，因其高效、低毒的特点而被广泛运用于多种肿瘤细胞的治疗研究中。本试验的研究结果显示，TSA可明显抑制肝癌HepG2细胞的生长，且抑制作用具有时间和浓度依赖性，提示TSA通过干预组蛋白的乙酰化水平，改变细胞的基因表达，进而抑制肿瘤细胞的增殖。TUNEL法检测细胞凋亡情况显示，TSA作用组TUNEL阳性细胞百分率呈上升趋势，并随TSA浓度的增加各组细胞凋亡率出现显著增加，说明TSA对肝癌HepG2细胞具有显著的致凋亡作用，证实TSA对肝癌细胞的抗肿瘤效应。

TSA可通过诱导肿瘤细胞生长阻滞、分化和凋亡，阻止肿瘤的浸润和转移，抑制肿瘤血管和淋巴管的生成等多种途径发挥抗肿瘤效应。为揭示TSA对肝癌HepG2细胞的促凋亡作用机制，笔者进一步通过免疫细胞化学法对FHIT蛋白和凋亡相关蛋白caspase-3、bax、bcl-2表达情况进行了检测。FHIT基因是1996年Ohta等用定位克隆技术及外显子捕获法在3p14.2区分离鉴定出的一个新基因，后研究[4]发现在多种原发性肿瘤及肿瘤细胞株中都存在FHIT基因的转录异常和FHIT蛋白的缺失或低表达，提示该基因可能是一种抑癌基因。Pichiorri、Vecchione等[5，6]研究发现人工诱导FHIT蛋白的过表达可抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤的形成，并且这种抑制作用与其诱导细胞凋亡、调控细胞周期密切相关。TSA诱导的肝癌细胞凋亡事件是否与FHIT表达相关的研究目前尚未见报道，笔者的研究结果显示，TSA可导致细胞中FHIT、caspase-3和bax表达增强，而对bcl-2无明显作用，提示FHIT、caspase-3和bax可能参与了TSA诱导的肝癌细胞凋亡发生，并且TSA可能是通过直接或上调FHIT的表达后间接启动凋亡机制发挥其促凋亡作用。

TSA虽具有抑制肿瘤细胞生长增殖的作用，但目前认为其单独使用临床疗效欠佳，还需寻找其它药物合用。有研究[7，8]发现美洛昔康、丙戊酸钠对人肝癌HepG2细胞具有明显的增殖抑制促凋亡作用，若将TSA与这些药物联合运用，可望更大程度地杀灭肿瘤细胞，这也是笔者后期将陆续开展的研究工作。

本试验以HepG2细胞为研究对象，通过观察TSA对其增殖抑制作用，阐明了TSA可能通过上调FHIT、caspase-3和bax的表达而促进细胞凋亡的发生，以上结果为揭示TSA作用肝癌细胞的可能机制、开发联合治疗方案提供了理论依据。

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[5]Pichiorri F，Trapasso F，Palumbo T，et al.Preclinical assessment of FHIT gene replacement therapy in human leukemia using a chimeric adenovirus，Ad5/F35[J].Clin Cancer Res，2006，12（11 Pt 1）：3494.

[6]Vecchione A，Sevignani C，Giarnieri E，et al.Inactivation of the FHIT gene favors bladder cancer development[J].Clin Cancer Res，2004，10（22）：7607.

[7]李 攀，赵春景.美洛昔康对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用[J].中国药房，2007，18（10）：744.

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