龙星胶囊药效学实验研究

贺中民 谢艳华 王四旺 杨 倩 第四军医大学药学系药物研究所(西安 710032)

1 实验材料

1.1 药品 龙星胶囊药粉,由第四军医大学药物研究所提供,准文号:20080321,临用前用蒸馏水配成不同浓度备用。

1.2 阳性对照药 消栓通络片,批号:20080601。

1.3 试剂 戊巴比妥钠,国药集团化学试剂有限公司,批号 WS20080401;胶原蛋白,Sigma,批号:-9879;盐酸肾上腺素,批号:0809301;冰醋酸,批号:080831;氢氧化钠,批号:2008228;活化部分凝血活酶(APT T)时间测定试剂盒,北京世帝科学仪器公司,批号:ST20201-22;凝血酶原(PT)时间测定试剂盒,北京世帝科学仪器公司,批号:STG10101-27;凝血酶(T T)时间测定试剂盒,北京世帝科学仪器公司,批号:STG20802-19;血小板诱导剂(ADP),北京世帝科学仪器公司。

1.4 仪器 德国 Sartorius电子天平(感量 0.1mg);TDZ5-WS多管架自动平衡离心机,湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司;钻石牌秒表(上海秒表厂);德国 Axioskop40蔡司显微镜;血小板聚集 /凝血因子分析仪(北京中勤世帝有限公司);CBV-1500A高性能无菌实验台,上海瑞仰净化装备有限公司;日立 KY2000型半自动生化分析仪。

1.5 动物 二级昆明种小鼠,雄雌各半,体重18～ 22g;SD大鼠 ,雌雄各半 ,体重 250～ 350g,均由第四军医大学实验动物研究中心提供,生产合格证号:scxk(军 )字 第 2002-005号。

2 方法和结果

2.1 龙星胶囊对凝血功能的影响 60只小鼠随机分为正常、阳性、消栓通 0.25g/kg、0.50g/kg、1.00g/kg五组,每组 12只,每天给药 1次,连续给药14d,于末次给药后 1h,将小鼠尾尖 1cm处用利剪剪断,立即秒表开始计时,至血液凝固为止即为出血时间[1]。血液自动流出,用滤纸吸去第 1滴血后,将血滴于清洁载玻片两端各 1滴,立即秒表开始计时,用 6号干燥针头沿血滴边缘向里轻轻挑动血滴,至针头能挑起纤维蛋白丝为止,即为凝血时间。

结果(见表 1)显示龙星胶囊 0.50g/kg、1.00g/kg给药 14d与正常对照组比较,有明显延长小鼠凝血及出血时间的趋势(P＜0.05或 P＜0.01)。

表1 龙星胶囊对小鼠凝血时间的影响(±s;n=12)

表1 龙星胶囊对小鼠凝血时间的影响(±s;n=12)

注:与正常组比较,△P＜0.05,▲P＜0.01。

组 别 剂量(g/kg) 出血时间(S) 凝血时间(S)正常对照 - 1150.58±40.52 127.75±65.92小剂量组 0.25g/kg 1225.00±38.00 171.80±67.51中剂量组 0.50g/kg 1528.70± 40.16▲ 183.70± 37.94△大剂量组 1.00g/kg 1550.00± 44.33▲ 215.18± 99.71△阳性组 1.00g/kg 1403.18± 39.51△ 204.18± 82.52△

2.2 龙星胶囊对血瘀大鼠血小板聚集率及凝血因子的影响 60只 SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性组、龙星胶囊 0.20g/kg、0.40g/kg、0.80g/kg六个剂量组,除正常对照组外,各组均造成血瘀模型。造模:参照文献[2]复制血瘀模型,但盐酸肾上腺素(Adr)的剂量及冰冻时间有所改变,具体操作如下:将1mg/mL的 Adr用生理盐水稀释 1倍,第 1d每隔 4h皮下注射 0.2mL稀释后的 Adr,共给 3次,在每 2次给药的中间时间将大鼠放入 0～2℃冰水中 4min进行冷刺激;第 2d仍按前日剂量给予 2次 Adr(间隔 4h),在 2次给药的中间时间将大鼠放入冰水中 3min进行1次冷刺激,模型即造成。 48h后大鼠 1%戊巴比妥钠(40mg/kg)行腹腔麻醉,腹腔静脉取血,置于 3.8枸橼酸钠抗凝管中。离心,测定血小板聚集率和凝血因子[3]。

结果(见表 2～3)与正常组比较,模型组血液中T T、PT、APT T内源性和外源性凝血功能明显缩短,血小板聚集率显著增高;龙星胶囊 0.20g/kg、0.40g/kg、0.80g/kg均能明显降低血瘀高凝大鼠模型Ⅱ因子活性,降低血小板聚集率,抑制内源性和外源性凝血系统,降低血液高凝状态,与模型组比较有明显差异(P＜ 0.05或 P ＜0.01)。

表2 龙星胶囊对血瘀大鼠的血小板聚集率的影响(±s;n=10)

表2 龙星胶囊对血瘀大鼠的血小板聚集率的影响(±s;n=10)

注:与正常组比较,△P＜0.05,▲P＜0.01;与模型组比较◇P ＜ 0.05,◆P ＜0.01。

组 别 剂 量 血小板聚集率(%)正常组 - 16.73± 3.04模型组 - 27.36± 4.68▲小剂量组 0.20g/kg 21.26± 2.14△◇中剂量组 0.40g/kg 19.13± 3.55△◆大剂量组 0.80g/kg 18.55± 3.20◆阳性组 0.80g/kg 23.24± 2.82▲◇

表3 龙星胶囊对血瘀大鼠凝血因子的影响(±s;n=10)

表3 龙星胶囊对血瘀大鼠凝血因子的影响(±s;n=10)

注:与正常组比较,△P＜0.05,▲P＜0.01;与模型组比较 ,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

组 别 剂 量 TT(s) PT(s) APTT(s)正常组 — 30.06±2.78 15.21± 1.90 36.84±3.91模型组 — 20.25±7.83▲ 7.40± 0.35▲ 25.93± 2.09▲小剂量组 0.20g/kg 28.05±5.19◇ 11.20±1.07◇ 30.81±3.39△◇中剂量组 0.40g/kg 30.74±3.09◆ 14.76±1.33◆ 36.01± 2.49◆大剂量组 0.80g/kg 29.30±2.69◆ 15.10±1.50◆ 37.25± 1.34◆阳性组 0.80g/kg 27.16±3.38△◇ 17.38± 1.77△◇ 35.00± 2.32◆

表4 龙星胶囊对小鼠体内血栓形成的影响(n=10)

2.3 龙星胶囊对胶原蛋白-肾上腺素诱发小鼠体内血栓形成的影响 取小鼠 60只,雌雄各半,随机分成正常组、阳性组、龙星胶囊 0.25g/kg、0.50g/kg、1.00g/kg五组,给药 14d,各组于末次给药后 1h,每只小鼠尾静脉注射胶原蛋白-肾上腺素混合血栓诱导剂[4](制备方法:称取Ⅰ型胶原蛋白 0.3g,加 6%醋酸液 60m L,浸泡过夜。研磨匀浆,4800r/min,取上清液冰箱 2℃保存。临用前以 20%NaOH调 pH后,以 8uL/0.2mL胶原蛋白比例加入盐酸肾上腺素注射液,混合即得)0.1m L/10g,观察注射后小鼠反应,小鼠死亡或15min内后肢麻痹未恢复者为阳性,15min内恢复者为阴性。计算存活率(即对血栓形成的保护率)。

结果(见表 4)表明龙星胶囊 0.50g/kg、1.00g/kg给药 14d与模型组比较,能明显增加小鼠存活率(P＜0.05或 P ＜ 0.01)。

3 讨 论

近年来以冠脉血栓和脑血栓为主的血栓栓塞性疾病的发病率呈上升趋势,严重危害人类的健康。血小板的粘附、聚集、释放反应可导致血栓形成、动脉粥样硬化等心脑血管疾病[5]。因此活血化瘀、通经活络是其主要的治疗原则。龙星胶囊由地龙、僵蚕、天南星(制)、水蛭等组成,具有活血化瘀,温经通络,祛风定惊,散结止痛的功效,用于治疗脑血栓引起的精神呆滞、舌质发硬、言语迟涩、发音不清、口眼歪斜、肢体麻木,半身不遂及动脉硬化症。临床上取得了良好的疗效。

对大鼠造成血瘀模型,发现与正常组比较,模型组血液中 TT、PT、APTT内源性和外源性凝血功能明显缩短,血小板聚集率显著增高;龙星胶囊 0.20g/kg、0.40g/kg、0.80g/kg均能明显降低血瘀高凝大鼠模型Ⅱ因子活性,降低血小板聚集率,抑制内源性和外源性凝血系统,降低血液高凝状态,与模型组比较有明显差异(P＜0.05或 P＜0.01)。凝血时间实验结果显示,龙星胶囊 0.50g/kg、1.00g/kg给药 14d与正常对照组比较,有明显延长小鼠凝血及出血时间的趋势(P＜0.05或 P＜0.01)。胶原蛋白-肾上腺素诱发小鼠体内血栓形成结果,表明龙星胶囊 0.5g/kg、1.0g/kg给药 14d与模型组比较,能明显增加小鼠存活率(P＜0.05或 P＜0.01)。表明龙星胶囊可以在活体中显示出抗血栓作用,本实验为龙星胶囊的临床疗效提供了药理学依据。

[1] 中华人民共和国卫生部药政管理局.中药新药研究指南(药学药理学毒理学)[M].1994:172.

[2] 陈 奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,1994:564-566.

[3] 张强宗,刘俊田,史小莲,等.水蛭免加热提取物对高凝动物模型凝血系统及血小板聚集率的影响[J].中国实验方剂学杂志,2006,12(5):47-49.

[4] 谢 辉,许惠琴 ,李 虹.薤白提取物对小鼠凝血时间及体内血栓形成的影响 [J].时珍国医国药,2004,15(12):811-812.

[5] 陈领朝,连秀峰,袁秉祥,等.脑络舒通胶囊对大鼠实验性脑及动静脉血栓形成的药效与研究[J].陕西中医,2002,23(4):376-377.