黄花蒿酵解液抑制 M CF-7肿瘤细胞活性的体外研究

张晨芳 张宏斌 寇晓梅 康慧鑫 柯永利 李 芬 李 燕

广州军区广州总医院普通外科(广州 510010)

黄花蒿(Artemisia annua L.)别名青蒿,菊科艾属一年生草本植物,为我国传统中药材,我国资源十分丰富。本研究主要是改变传统的青蒿素制备工艺,通过发酵的方法制备出一种低毒的可以长期用来口服的新型的类似青蒿素的药物,来抑制乳腺癌 MCF-7细胞的活性,从而为黄花蒿酵解液对抗乳腺癌的药用价值的进一步开发提供新的科学依据。

1 材料和方法 1.1 材料和试剂 M CF-7细胞由广州军区广州总医院医学实验科细胞室提供,黄花蒿原草产于西安,RPM I-1640培养液(吉诺生物公司),新生小牛血清(杭州四季青),M TS试剂 (PROM EGA公司),胰蛋白酶 (吉诺生物公司),0.2um过滤膜。

1.2 药物制备 将糯米(1.5kg)浸泡后,蒸熟后冷水淋却,使温度降至 28～ 30℃,入大缸 ,搓散饭块,拌入酒药 (0.15kg),搭醅挖凹,凹底直径约 15cm,饭面再薄薄撒一层酒药,加盖 ,保温;经 24～ 30h后出酿液,开动缸盖 ,使缸内温度降下来,并可排出 CO2,供给 O2,促进发酵;24h后酿块浮起,按比例倒入冷水,切块、翻转;48h后倒入米 (浸泡、蒸熟透后)3kg,黄花蒿叶末 40h,加曲 (0.05kg)拌匀,进行前期发酵。过 12-18h后排除 CO2,72h后每缸倒入米饭 (浸泡、蒸熟透后 )2kg,黄花蒿叶末 3kg,加曲(0.02kg),拌缸 ;96h后,灌入小埕(每埕 3kg),液面距埕口约 10cm,扎好埕口,以利于在低温、低氧下进行主发酵(慢发酵)90d。取上清离心 3000r/min,30min,经 0.2um过滤膜过滤除菌,得浓度为 200g/L的酵解液备用。

1.3 实验方法 1.3.1 M CF-7细胞培养:培养液为含 10%小牛血清的 RPM I-1640培养液。将 25cm3培养瓶置于5%CO2、37℃、饱和湿度的恒温箱中培养,待细胞数达 90%左右时,用 0.25%胰蛋白酶消化后传代。实验期间冻存细胞,实验全过程均用对数生长期的细胞。

1.3.2 药物处理后的分组情况:取对数生长期细胞,0.25%胰蛋白酶消化细胞后,细胞计数板计数,调整细胞浓度为 5× 103个 /100uL培养液,接种于 96孔板中。于 5%CO2、37℃、饱和湿度的恒温箱中培养,待细胞完全贴壁后加入药物。按黄花蒿酵解液终浓度分组,即黄花蒿酵解液 10g/L、20g/L、30g/L、40g/L组,不同浓度培养相同时间 ,加入等量含 10%小牛血清的培养液组为对照组。

1.3.3 M TS法细胞增殖实验:将 M CF-7细胞接种于 96孔板,每孔细胞数 5× 103个(分组同上 );细胞贴壁后 ,加入黄花蒿酵解液,使药物终浓度为 10g/L、20g/L、30g/L、40g/L,3个复孔 ,每板重复 3次 ,培养 48h。移液枪小心吸去所有上清夜,每孔加入 200ul无血清培养基及 40ulM TS,铝箔包好培养板,培养 2h,酶标仪 490nm波长测光密度(OD值);肿瘤生长抑制率=(1-药物组 D值 /对照组 D值 )×100%。

1.3.4 倒置显微镜下观察细胞形态变化:培养 48h于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照 (图 1)。

图1 加药组与对照组细胞形态及细胞量的比较

1.3.5 统计学方法:采用 SPSS10.0软件包进行统计学分析,组间差异采用i2检验,均取 P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果 黄花蒿酵解液对乳腺癌 M CF-7细胞有抑制作用,并随着黄花蒿酵解液剂量的加大其抑制作用增强,当药物浓度达 30g/L以上 ,其抑瘤作用相对恒定。

2.1 黄花蒿酵解液对 MCF-7细胞增殖的抑制作用 4种浓度的黄花蒿酵解液作用一定时间后均可抑制 M CF-7细胞的增殖,其抑制率最高可达 86.7%(表 1,图 2)。

1 不同浓度黄花蒿酵解液对 MCF-7细胞增殖的影响(±s,n=4)

1 不同浓度黄花蒿酵解液对 MCF-7细胞增殖的影响(±s,n=4)

(P＜0.05)

抑制率(%)组 别细胞增殖情况(OD值)48h 48h 10g/L 0.84±0.083 10.0 20g/L 0.48±0.006 48.7 30g/L 0.14±0.008 85.2 40g/L 0.12±0.025 86.7对照组 0.93± 0.082 0

图2 药物作用 48h后细胞存活率(M TS法)

讨 论 目前国内外有许多体外实验证实青蒿素及其衍生物对乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤和白血病细胞株高度敏感[1]。但青蒿素的提取工艺复杂,并多用于工业提取,很难被人体吸收;且其抗乳腺癌作用并没有它的衍生物如双氢青蒿素、青蒿琥酯等作用强,故而我们采用新型的制备方法,制成黄花蒿酵解液,其主要成分为青蒿素的类似物,这种制备工艺不仅简便,且可节省原材料,其成品还可用于口服,易于被人体吸收,使用方便。

通过使用不同的药物浓度进行实验,发现黄花蒿酵解液对MCF-7细胞作用 48h具有很强的杀伤作用,其抑制率最高可达:86.7%,最低达:10.0%。文献表明,肿瘤药物敏感实验体外实验结果与体内化疗疗效总符合率高达 85%[7]。

以上结果显示,此酵解液对 M CF-7细胞可能有杀伤作用。但是,由于本药物为纯中药制剂,虽然仅黄花蒿一味药物,然而其具体成分复杂,难以分析完全。实验中我们遇到很多问题有待解决,如本药物的渗透压无法用一般的冰点渗透压仪测出,而渗透压过高或过低都会导致细胞死亡。再如,实验前测得本药物偏酸,众所周知,药物偏酸也会导致细胞死亡,故而前面的结果值得怀疑。实验过程中我们曾想过办法中和本药物的酸性,并调节本药物的渗透压 ,但都认为不妥。中药作为一种特殊的药物,主要是依靠其药物的偏性(毒性)发挥作用的 ,药物的四气五味,剂型,剂量 ,煎煮方法、火候 ,加水的多少等等都会直接影响疗效。本药物有其固定的剂型,一经改变某些条件,则可能不再是本研究药物。我们考虑这些问题在动物体内可能会被均衡掉,或者经过某些转换中和掉这些因素,再或者本药物有可能就是靠这些性味发挥作用,这些机理暂无法求证。以上问题几乎所有纯中药在作体外实验时均可能遇见。

[1] Chen PQ,Yuan J,Du QY,et al.Effectsof dihydroartemisinin on fine structure of srythrocytic stages of plasmodium berghei ANKA strain[J].Acta Pharmacol Sin,2000,21(3):234.

[2] 韩 锐.肿瘤化学预防及药物治疗 [J].北京:北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社,1991.418.