靶向TLR9含非甲基化CpG寡核苷酸片段的合成及筛选

刘慧敏,范凌云,张瑞英,张美莲,马军格

(河北工程大学附属医院,河北邯郸 056029)

研究发现[1],Toll样受体-9(TLR9)参与了系统性红斑狼疮(SLE)患者体内抗dsDNA抗体的产生,且可能是产生抗dsDNA抗体的重要机制之一。TLR9可被非微生物的内源性配体活化[2]。2008年2月 ～2009年12月,我们在无菌条件下取SLE患者外周血,模拟设计并人工合成含非甲基化磷酸胞苷酰(CpG)寡核苷酸片段,用于阻断SLE患者外周血单一核细胞上的TLR9,观察该片段能否使SLE患者机体减少甚至不产生致病性抗dsDNA抗体。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RPMI 1640、胎牛血清,小牛胸腺DNA(nCTDNA)、Protein Detector TMELISA试剂盒。

1.2 含非甲基化CpG寡核苷酸片段的设计及合成设计含非甲基化CpG的寡核苷酸片段(拟合成的寡核苷酸序列为Cp GODN(5′-TCCATCACGTTCCTGATGCT-3′),由北京赛百盛生物技术有限公司合成。

1.3 人外周血单一核细胞(PBMC)的制备及培养无菌条件下取SLE患者(60例)外周血,肝素抗凝,淋巴细胞分离液常规分离PBMC,调整细胞浓度为5×106/ml,于37℃、5%CO2饱和湿度的孵育箱中培养。

1.4 实验分组及抗dsDNA抗体测定 A组为实验组：PBMC培养液中加入人工合成的寡核苷酸片段(按终浓度10 ng/ml),再用nCTDNA作为免疫原刺激PBMC;B组为阳性对照组：用nCTDNA作为免疫原刺激PBMC;C组为阴性对照组：PBMC培养液中加入等量PBS,再用nCTDNA作为免疫原刺激PBMC。用ELISA法检测各组细胞上清液中抗dsDNA抗体,按文献[3]的方法操作。每样本重复 3次。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件,资料比较用单因素方差分析和 χ2检验。α=0.05。

2 结果

成功合成了含非甲基化CpG的寡核苷酸片段,并经测序签定为所需要的寡核苷酸片段。A、B、C组细胞上清液中抗dsDNA抗体浓度分别为1.21、0.24、0.08 pg/m l,A组明显高于B组(P＜0.05),虽然也较C组升高,但P＞0.05。

3 讨论

SLE的发病机制尚不完全清楚。目前多数学者认为可能是由于一个具有遗传素质者,在环境因素或(和)性激素的影响下,触发了机体异常免疫应答,持续产生大量免疫复合物和致病性自身抗体,引起组织损伤和各种临床症状[4]。其中,自身抗体产生在SLE的发病过程中起重要作用,并可引起多系统、器官功能损害等并发症[5]。

研究发现[6],SLE模型和患者体内均有多克隆B细胞的激活,后者产生大量自身抗体。主要表达在人B细胞上的TLR9是天然免疫受体TLR家族成员之一[7],它通过特异地识别含非甲基化CpG基因序列的细菌和病毒DNA及人工合成的寡核苷酸,激活机体的天然免疫,且也为获得性免疫中免疫细胞的活化提供刺激信号,在抗感染免疫和变态反应性疾病的发病中具有重要作用[8]。我们的前期研究结果表明[1],TLR9参与了SLE患者抗dsDNA抗体的产生,且TLR9介导的抗dsDNA抗体产生是经由髓样分化因子88(MyD88)依赖的MyD88/白介素受体相关激酶(IRAKs)/肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)/NF-κB诱导激酶(NIK)/NF-κB经典路径发生的。本研究中,我们模拟设计并合成了含非甲基化CpG的寡核苷酸片段,经过生物学活性测定筛选出一条寡核苷酸多肽,能抑制抗dsDNA抗体产生,说明该人工合成的含非甲基化CpG寡核苷酸片段能与表达于PBMC上的TLR9竞争性结合,抑制抗dsDNA抗体的产生。

总之,我们成功合成并筛选出靶向含非甲基化CpG的寡核苷酸片段。但该寡核苷酸片段的安全性、毒性等有待进一步观察研究。

[1]刘慧敏,张瑞英,耿静,等.Toll样受体-9在SLE患者产生抗dsDNA抗体中的作用[J].中华皮肤科杂志,2007,40(1)：25-27.

[2]Marshak-Rothstein A,Busconi L,Lau CM,et al.Comparison of CpGs-ODNs,chromatin immune complexes,and dsDNA fragment immune complexes in the TLR-9-dependentactivation of rheumatoid factor B cells[J].JEndotoxin Res,2004,10(4)：247-251.

[3]李智铭,徐世正,林孝华,等.CpG序列在诱生抗dsDNA抗体中的作用[J].中华皮肤科杂志,2004,37(12)：687-689.

[4]刘嘉玲.系统性红斑狼疮与心血管病[J].中国临床医生, 2005,33(4)：14-16.

[5]曾晓锋,刘坚,金涛,等.系统性红斑狼疮死亡的法医学检验及其死因和临床病理分析[J].中华现代临床医学杂志,2006, 4(17)：1548-1550.

[6]王玉玺,王丽,王俊志,等.祛毒胶囊对狼疮样小鼠外周血白细胞介素-6、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的影响[J].中华现代皮肤科学杂志,2005,25(6)：193-194.

[7]章晓联,潘勤.Toll样受体在免疫学方面的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2002,18(5)：670-672.

[8]BernasconiNL,Onai N,Lanzavecchia A.A role for Toll-like receptors in acquired immunity：up-regulation of TLR 9 by BCR triggering in naive B cells and constitutive expression in memory B cells[J]. Blood,2003,101(11)：4500-4504.