γ-hGH对乳腺癌细胞 MCF-7的放射敏感性研究

戴启明 周士福 刘小健 时伟峰

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一[1],保乳术后紧随着外部放疗是目前局限性乳腺癌的标准化治疗,同时是预防保留乳房手术后局部复发的重要手段。重组人生长激素(recombinant human growth hormone,γ-hGH)在促进 Turner综合征和慢性肾脏病患生长[2]、治疗充血性心力衰竭[3]、治疗重症急性胰腺炎[4]、纠正低蛋白血症[5]等方面有重要作用,但 γhGH对乳腺癌细胞 MCF-7放疗增敏方面的作用研究较少。本实验就 γ-hGH对乳腺癌 MCF-7的放射敏感性做一研究,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

人乳腺癌细胞株 MCF-7购自中国科学院上海细胞所。10%胎牛血清、DMEN培养基购自杭州四季清公司,γ-hGH由本医院中心实验室惠赠,流式细胞仪、超净工作台、恒温培养箱等相关仪器由本院中心实验室提供,照射器由本院放疗科提供。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将实验分为以下 4组,每组设 5个复孔。对照组 :MCF-7+DMEN培养基;照射组 :MCF-7+DMEN培养基 +照射;作用组 :MCF-7+DMEN培养基 +r-hGH;联合作用组:MCF-7+DMEN培养基 +r-hGH+照射。

1.2.2 细胞培养及电子射线照射 将乳腺癌 MCF-7细胞培养于 37℃、5%CO2恒温培养箱中后,每天观察细胞生长情况,待细胞处于对数生长期即可用于实验。实验开始前 24 h更换培养基、胰酶消化,利用计数板方法计数并调整细胞数目,待乳腺癌细胞数调整为 1×105/m l,接种于 6孔板培养。按照上述分组处理细胞后,继续置于恒温培养箱中培养,培养时间按照实验的需要来决定。其中电子线照射由本院放疗科工作人员利用直线加速器照射,6 Mev、剂量 4 Gy垂直照射细胞培养瓶贴壁面,照射时间为 3 min。

1.3 细胞计算方法

1.3.1 流式细胞术检测细胞凋亡率 将上述 4组经处理后,继续放置培养箱培养 24 h后,用流式细胞仪检测其细胞凋亡率。

1.3.2 活细胞计数测定细胞存活率 将上述 4组经处理后,继续放置培养箱培养 48 h后,台盼蓝拒染法计数活细胞数。细胞存活率的计算公式如下:细胞存活率 =每组活细胞平均数/对照组活细胞平均数 ×100%。

1.3.3 克隆形成法测定细胞抑制率 将上述 4组经处理后,将细胞用 0.25%胰酶消化,1×105个细胞接种于 36 cm2培养皿中,每天观察细胞生长情况,根据需要更换培养液,培养 10天后,10%亚甲基蓝染色 20 min、晾干,显微镜下观察并计数,计数大于 50个细胞的克隆数。用抑制率表示不同处理因素对细胞克隆形成的影响。各组抑制率 =(1-各组克隆数/对照组克隆数)×100%。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组作用下的细胞凋亡率

对照组为 0.00%,照射组为(1.06%±0.48%),作用组为(0.96%±0.38%),联合作用组(10.8%±3.46%)。照射组和对照相比,凋亡率有所上升(P＜0.05),作用组和对照组相比,凋亡率有所上升(P＜0.05),联合作业组和对照组相比,凋亡率呈明显下降(P＜0.01),联合作用组和照射组、作用组相比,凋亡率也明显改变(P＜0.05),而照射组和作用组相比,凋亡率却无明显改变(P＞0.05)。

2.2 各组作用下的细胞存活率

对照组、照射组、作用组、联合作用组的细胞存活率分别为:100.0%、51.7% ±1.10%、57.7% ±1.20%、11.0%±1.00%,其中照射组、作用组和对照组相比有所下降(P均 ＜0.05);联合作用组和对照组相比,细胞存活率明显下降(P＜0.01);而照射组和作用组并无明显改变(P＞0.05);联合作用组和照射组、作用组相比也有所下降(P均 ＜0.05)。

2.3 各组作用下的细胞抑制率

对照组、照射组、作用组、联合作用组的细胞抑制率分别为 0、20.9%±0.65%、26.0%±1.10%和 67.9%±0.93%,和对照组相比,照射组、作用组的抑制率有所增加(P＜0.05),而联合作用组则明显增加(P＜0.01),照射组和作用组并无明显改变(P＞0.05),联合作用和照射组、作用组相比也有所增加(P均 ＜0.05)。

3 讨论

生长激素是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的 1种蛋白质激素,由 191个氨基酸残基组成,它的主要功能是促进物质的代谢和生物的生长发育。最早被人们认识和运用的作用是促进人体生长,它通过促生长因子或胰岛素样生长因子介导作用于软骨组织,增加骨骼的长度,从而促进人体的线性生长。生长激素 1958年首次被提取,由于当时条件的限制,人生长激素的来源仅为尸体脑垂体,所以生产量有限,因此人们开始研究以化学合成和基因重组方法生产人生长激素。1986年基因工程的发明人之一、诺贝尔奖获得者波耶尔通过基因重组技术成功合成了重组人生长激素,其结构与人垂体分泌的生长激素完全相同[6]。γ-hGH大量生产后,人们对它的临床应用开始越来越多的进行研究。而乳腺癌患者保乳手术后的放疗一直是个控制局部复发率的有效手段。早期乳腺癌保乳治疗的原理是用手术切除乳腺原发病灶,用中等剂量放疗控制乳腺内亚临床灶,达到与改良根治术相同的效果,不仅保留了完整的乳房,有着很好的美容效果及功能,而且其长期生存率、局部控制率均和根治术或改良根治相同[7]。许多学者经过长期的随访发现当保乳手术后不予放疗明显提高局部的复发率[8,9],因此对乳腺癌细胞放射敏感性的研究有一定的意义。

我们本实验目的是观察 γ-hGH是否能增强乳腺癌 MCF-7细胞对电子射线的敏感性。但乳腺癌细胞的辐射敏感性除了和射线的种类和剂量有关,也和肿瘤细胞的分子生物学等许多因素密切相关。从本次实验的结果可以发现,在联合作用组下的细胞凋亡率和对照组、照射组、作用组相比,均明显增加(P均 ＜0.05),细胞存活率均相应地减少(P均 ＜0.05),细胞抑制率均明显增加(P＜0.01),说明经过 γ-hGH作用后再予以电子射线照射明显可以提高细胞的凋亡率,降低细胞存活率,乳腺癌细胞受抑制的情况也更加严重。这些现象可以说明经放射和 γ-hGH联合作用下具有一定的协同作用,同时也说明了 γ-hGH能够增强乳腺癌 MCF-7细胞对电子射线的放射敏感性,其中的原因可能是因为作用于乳腺癌 MCF-7细胞的细胞周期内有丝分裂中的靶点。

γ-hGH在临床上的应用范围正日益扩大,而从本次实验中得出的 γ-hGH能够增强乳腺癌 MCF-7细胞对电子射线的放射敏感性这一结论将有可能为标准化的保乳手术术后治疗提供一定的帮助。

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