端粒酶与肿瘤的诊断和治疗

杨仕明,陈 陵,余松涛,房殿春

(第三军医大学全军消化病研究所,重庆,400038)

2009年诺贝尔生理学或医学奖授予了加州大学旧金山分校的Elizabeth Blackburn,约翰霍普金斯大学的Carol Greider,以及哈佛医学院的Jack Szostak。诺贝尔奖主页上介绍他们获奖的原因是揭示了“染色体是如何被端粒和端粒酶保护的”。

其实,早在上个世纪 30年代,Barbara Mc-Clintock女士(因为发现玉米的转座子获得诺奖)以及Hermann J.Muller(因发现X射线的诱变作用获得诺奖)注意到,自然断裂的染色体很容易端-端融合,而正常染色体的自然末端,为什么不容易相互融合呢?合理的推测是,染色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂末端,它应该有一个特殊的结构来避免染色体之间的相互融合,这个染色体的末端结构被称之为端粒(telomere)。染色体端粒的假说最后被Blackburn所证实[1-3],作为Blackburn的学生,Greider证实了端粒酶的存在[4],而Szostak应用Blackburn的端粒成分,成功构建了人工染色体[2],从而使DNA的大片段克隆成为可能,并为人类基因组测序的工作立下了汗马功劳。

由于端粒及其相关蛋白的陆续被发现,以及端粒酶及其相关亚单位的克隆,现在人们已明白,在体细胞有丝分裂过程中,每有丝分裂一次,端粒长度就会丢失一部分,当染色体端粒长度不足以维持细胞功能时,细胞便会退出细胞周期而衰老死亡,这也就是染色体端粒长度可以作为细胞有丝分裂钟的原因。端粒的作用在于维持染色体结构的完整性,防止染色体末端被降解,而端粒酶的作用在于维持染色体端粒长度。正常体细胞由于端粒酶没有活化,染色体端粒长度随着细胞有丝分裂而逐渐缩短,最后衰老死亡;肿瘤细胞由于端粒酶的活化,使肿瘤细胞的端粒长度可以维持一种动态平衡,肿瘤细胞才得以无限制地增殖。当然,85%以上的肿瘤组织或细胞端粒酶是阳性的,只有极少数的肿瘤细胞端粒酶为阴性,这类肿瘤细胞的端粒长度是通过ALT途径来维持[5-6],具体的机制现在仍不明确。

过去一直认为肿瘤端粒酶的活化是肿瘤细胞无限增殖有关,但临床研究发现,端粒酶的活化还与肿瘤患者的不良预后亦密切相关。那么,肿瘤细胞的端粒酶活化是否参与了肿瘤的侵袭和转移的过程呢?为此,我们将端粒酶催化活化亚单位(hTERT)转染到端粒酶阴性的肿瘤细胞中,结果发现转染了 hTERT的U2OS骨肉瘤细胞(U2OS/hTERT)不仅体外增殖能力增强,体外穿膜能力亦明显增强,进一步将不同的转染细胞经裸鼠尾静脉注射到裸鼠体内,采用动物荧光成像系统发现U2OS/hTERT细胞肺转移能力较转染了空载体的 U2OS细胞(U2OS/EGFP)明显增强,提示端粒酶的活化可以明显增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。那么,端粒酶活化增进肿瘤细胞转移的机制是什么,作者采用生物力学方法,研究了不同转染细胞与细胞外基质的粘附能力,结果发现hTERT转染可以明显增强肿瘤细胞与细胞外基质的粘附能力[7]。粘附分子家族在肿瘤的侵袭转移中具有重要作用,hTERT通过何种途径增强、活化了哪一类的粘附分子,从而增强了肿瘤细胞与细胞外基质的粘附作用,促进了肿瘤的转移,这是作者下一步需要研究的重点。以上研究表明,端粒酶的活化不仅是肿瘤发生的早期事件,与肿瘤细胞的无限增殖有关,而且还参与了肿瘤的侵袭和转移。因此,端粒酶及其hTERT亚单位可以作为肿瘤诊断和治疗的良好靶标。

在肿瘤的诊断方面,由于端粒酶在85%以上的恶性肿瘤中表达,监测组织或体液中端粒酶的活性有助于肿瘤的诊断。有学者检测胸腹水中或尿液脱落细胞端粒酶的活性,发现恶性胸腹水中端粒酶的活性明显高于良性患者[8],而尿液中端粒酶活性的检测有助于发现泌尿系统的恶性肿瘤的诊断以及术后复发的判断[9-10]。近年来随着分子影像技术的进步,利用端粒酶hTERT亚单位在肿瘤组织中表达的相对特异性,通过hTERT启动子启动下游报告基因的表达,从而实现活体实时肿瘤显像成为研究的热点[11]。为此,我们通过全基因合成文献报道的优化型的hTERT启动子[12],将其克隆至慢病毒载体中,其下游克隆EGFP全长cDNA作为报告子,利用活体光学成像技术研究了hTERT靶向性活体光学成像技术在肿瘤实时诊断中的作用,发现含有优化型hTERT启动子的慢病毒体外感染细胞后,能够在端粒酶阳性肿瘤细胞内特异表达GFP,在体实验发现,感染含优化型hTERT启动子的慢病毒之后,端粒酶阳性活体肿瘤能够被特异性的实时观察到,并且肿瘤内的GFP信号在存活裸鼠体内维持30天,随肿瘤增大而增强。该研究提示优化后hTERT启动子对报告基因的调控具有严格的端粒酶特异性。结合小动物活体光学成像系统,荷瘤裸鼠内的端粒酶阳性肿瘤能够被无创的、实时的、特异性的成像,为肿瘤的特异性早期诊断提供了新的实验依据[13]。

在肿瘤的治疗方面,端粒酶及其hTERT亚单位不仅可以作为肿瘤基因治疗的靶点,还可以作为一种肿瘤共有抗原用于肿瘤的免疫治疗。已有大量的研究表明,无论是反义技术、RNA干扰技术均可以下调肿瘤组织端粒酶的活性,从而达到抑制肿瘤的目的[14-16],第二种基因治疗方法是采用hTERT启动子的端粒酶靶向性,将自杀基因克隆到hTERT启动子的下游,从而达到定向杀伤端粒酶阳性肿瘤细胞的目的[17]。

近年来,免疫治疗作为继手术、化疗、放疗之后的第4种肿瘤治疗模式由于其特异性好,毒副作用小,越来越受到学者的重视。基于树突状细胞(DC)的肿瘤免疫治疗因其毒副作用小、特异性强、操作简单等优势成为肿瘤免疫治疗研究的热点。将肿瘤相关抗原(TAA)与DC相结合,通过DC对肿瘤抗原的高效提呈作用激发机体的特异性抗肿瘤免疫反应是肿瘤免疫治疗的一个热门课题。目前多采用TAA致敏的DC免疫机体,以产生抗原特异性的抗肿瘤反应。虽然TAA致敏的方法有多种,但目前发现的肿瘤相关抗原大多具有组织特异性,如MARR-1只针对黑色素瘤、PSA只针对前列腺癌、CEA只针对消化道肿瘤或肺癌、AFP只针对肝癌等,以这些肿瘤相关抗原来进行免疫治疗,只能对相应的肿瘤起作用,而对不表达该抗原的其他来源的肿瘤不具有杀伤作用。因此,寻找肿瘤特异性的共有抗原成为肿瘤免疫治疗关键问题。理想的肿瘤共有抗原(universal tumor-associated antigen)应符合[18]:①在绝大多数肿瘤组织中表达从而可以广泛应用;②只表达于肿瘤细胞以避免自身免疫反应;③不表达于正常成熟组织以避免免疫耐受;④在肿瘤的发生发展过程中具有不可替代的作用,以避免抗原缺失;⑤能诱导足够强度的免疫反应并导致肿瘤消退;⑥同时包含有MHCⅠ和MHCⅡ类分子,从而可诱导CD4+和CD8+T细胞反应。端粒酶由于主要在肿瘤组织和部分癌前组织中表达外,在正常体细胞内少有表达,如果肿瘤细胞为逃避免疫监视而下调端粒酶的表达,其本身就足以抑制肿瘤细胞的增殖和转移,因此,端粒酶可以作为一种广谱的肿瘤转移相关抗原用于中晚期肿瘤的免疫治疗。作者将hTERT全长基因序列克隆到腺病毒载体内,经293细胞重组包将后,将病毒颗粒负载DC,可以诱导产生hTERT特异性的CT L细胞,对端粒酶阳性且HLA相匹配的肿瘤细胞具有杀伤效应,对端粒酶阴性或HLA不匹配的肿瘤细胞不具有杀伤效应,更为可喜的是,hTERT特异性CTL细胞对表达少量端粒酶的自体淋巴细胞和 DC不具有杀伤效应,提示hTERT负载的DC疫苗具有端粒酶特异性且受HLA的限制,这种疫苗对肿瘤细胞的杀伤具有高效、特异、安全的特点,为端粒酶疫苗的抗肿瘤效应提供了实验依据[19-20]。

目前的研究表明,CD8+T细胞所识别的靶抗原需先经抗原递呈后,以“抗原肽-MHCⅠ类分子”复合物的形式呈现于抗原递呈细胞(APC)或靶细胞表面,才能被CD8+T细胞所识别。相应的与主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类分子结合的抗原肽即为CTL表位(cytotoxic T lymphocyte epitopes)[21]。随着对免疫应答分子机制的深入研究,人们已认识到机体的免疫细胞并不是一一对应于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子,而是针对各种各样抗原分子的抗原表位(epitope),蛋白质抗原是通过其表位来体现其免疫特异性。因此,在表位水平上对抗原性的认识已促成这样一种趋势:基于抗原分子的免疫干预手段已不再停留在病原体或天然抗原的整体水平,而开始向 CT L表位水平过渡[22-23]。由于hTERT全长cDNA可以诱导产生hTERT特异性的CTL反应,那么在hTERT全长氨基酸序列中一定存在能够诱发这种CT L反应的抗原表位。事实上,受不同Ⅰ类分子限制的hTERT的CTL表位陆续被发现,部分已进行了临床实验,证明有一定的抗肿瘤活性[24]。

总之,由于端粒酶及其hTERT亚单位在肿瘤发生发展过程中的重要作用,以及它在肿瘤组织中表达的相对特异性,端粒酶在肿瘤的诊断及治疗中将可能发挥重要的作用。

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