我国细菌内毒素检查法的应用进展

周筱莉

（广西壮族自治区桂林食品药品检验所，广西桂林 541002）

药品注射剂的热原检查是保证药品安全的重要检验项目。半个多世纪以来，采用家兔法（PT法）检查热原曾对保证药品的安全发挥了重要的作用，但是家兔法耗时长，不经济，且有很多局限性。细菌内毒素检查法（BET法）因其简便、灵敏、快速、准确等优点，已被广泛用于检查药品注射剂及其原料药和临床医疗器具中的致热物质，并逐步替代传统的PT法检查热原。我国学者从20世纪70年代初期就开始对BET法进行了研究。近年来，我国广大的医药学工作者为扩大BET法的应用，对注射用原料药及其注射制剂和输液制剂生产过程、临床医学的应用及所涉及的设备器具可能引入的热原进行了广泛的应用研究。笔者通过检索查阅近5年以来医学和药学方面公开报道的文献资料，对我国近年来对BET法的应用研究进展作一综述。

1 BET法在药用原料及注射制剂检查的研究

1.1 化学药品

《中国药典》2005年版二部（化学药品）需用BET法检查热原的药品有73个品种的原料药及其注射制剂共205个。此外，有文献报道认为能用于BET法检查化学原料药及注射制剂中的热原有卡铂原料药、5种氨基酸原料药、三磷酸腺苷二钠注射液、注射用脱氧核糖核酸等四十余种。

药厂在制备注射制剂过程中，药品从原料到成品的多道工序都要进行热原监测。卡铂是一抗肿瘤原料药，标准未要求做热原检查及细菌内毒素检查，其注射制剂规定做家兔热原检查。研究认为卡铂原料药用BET水稀释到5 mg/ml的浓度，用凝胶限量法试验无干扰，可建立卡铂BET法[1]。

杨善彬等[2-3]对注射用L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸4种氨基酸原料药BET法可行性进行了研究，并对现行标准进行方法学验证。 在16倍稀释级下，L-缬氨酸（C=2.5%）对鲎试剂（TAL）无干扰，用灵敏度为0.5 EU/ml的TAL检查其内毒素方法可行，其细菌内毒素含量＜0.04EU/ml，显著高于《中国药典》2005年版二部的规定（5 EU/ml）。认为L-缬氨酸和L-异亮氨酸在2～16倍的稀释级下（C=2.5%）时对TAL无干扰，检测细菌内毒素的TAL灵敏度≤0.04 EU/ml，而在16倍的稀释级范围内，L-脯氨酸（C=4.5%）和L-亮氨酸（C=2%）对TAL有抑制作用。

硫酸阿托品注射液为临床常用非选择性M胆碱受体阻断剂，是《中国药典》2005年版收载的品种，原质量标准中无热原检查项目。高锦等[4]认为用灵敏度分别为0.25 EU/ml和0.125 EU/ml的TAL检测其稀释液0.25 g/ml及更低浓度时，无干扰因素影响。将硫酸阿托品注射液细菌内毒素限值（L）确定为50 EU/ml，可用于BET法检查。

盐酸丁卡因注射液是局部麻醉药。丘树胜等[5]利用丁卡因的脂溶性将其萃取后进行细菌内毒素检查，实验结果显示20批盐酸丁卡因注射液中细菌内毒素均低于0.5 EU/ml。认为用萃取法制备供试液试验，可真实地反应该药品中细菌内毒素的污染程度。

亚甲蓝注射液在临床上主要用于氰化物、硝酸和亚硝酸盐中毒的解救，其细菌内毒素的含量是影响该药品质量的重要指标。肖贵南等[6-7]采用动态比浊法对亚甲蓝注射液和低分子量肝素钙注射液进行定量检测，并与凝胶法结果比较，亚甲蓝注射液在浓度为0.125 mg/ml时对试验无干扰，所测样品（10 mg/ml）的细菌内毒素均＜0.25 EU/ml；低分子量肝素钙注射液稀释至12.5 IU/ml对试验无干扰作用，检查样品中细菌内毒素的含量均＜0.01 IU/ml，与凝胶法结果基本一致，认为这2个品种可建立BET法。

抗凝剂溶液常用于临床血液的保养，药品标准要求作细菌内毒素检查。该品种主要成分枸橼酸及枸橼酸钠会对细菌内毒素产生严重干扰。熊向党[8]提出用含有氢氧化钙的稀释剂稀释样品11倍可以消除对细菌内毒素的干扰作用；柏玉碧等[9]认为将样品用检查用水稀释40倍用于试验可排除干扰因素。

1.2 中药注射剂

《中国药典》2005年版一部尚未收载中药注射剂。在现行国家药品标准（新药转正标准）2008年版中，有4个化学药注射剂（含有中药成分）规定用BET法代替PT法。有文献认为，可建立BET法的中药注射剂有金叶败毒注射液、舒血宁注射液、灯盏花素注射液等近20个品种。张德波等[10]在现行国家标准的基础上对紫杉醇注射液BET法进行了再研究，确定合理的紫杉醇注射液内毒素L及最大不干扰试验浓度。结果证明使用现行国家标准所确定的内毒素L为0.4 EU/ml不变，三批紫杉醇注射液的干扰试验0.075 mg/ml（对应使用灵敏度为0.4 EU/ml）符合要求。倪立坚[11]用半定量法估算生脉注射液细菌内毒素的含量，认为该药品可建立BET法。

1.3 生物制品

《中国药典》2005年版第三部（生物制品）有46个品种用于注射给药，其中有16个制剂需用BET法检查热原。白春杰等[12]研究BET法与PT法检测破伤风抗毒素细菌内毒素结果的相关性，按照标准操作建立其检测方法，供试品在最大有效稀释倍数下试验无干扰。细菌内毒素检测结果与热原检查结果对比，检测10批破伤风抗毒素细菌内毒素限量符合规定，与PT法对比完全相同。应莲芳等[13]将重组人型肝炎疫苗供试品用PT法及BET法进行试验，溶液浓度在40μg/ml，确定L为40 EU/ml，对试验无干扰。该疫苗用BET法可代替PT法。李红芳等[14]对乙型脑炎减毒活疫苗用凝胶限量法，将供试品稀释160倍，L定为40 EU/ml进行试验结果对实验无干扰。认为可用于乙型脑炎减毒疫苗中间产品的细菌内毒素检查。

2 BET法在制药生产工艺中的研究

在注射剂制药生产流程中及所用试验器材常常受到热原污染，250℃干热60 min是除去热原的常用方法。为了确认隧道式烘箱和干热恒温箱腔内不同位置的热分布情况，除热原程序能否达到预先设计要求。湛江海洋生物有限公司对隧道烘箱及干热烤箱去除内毒素效果进行了验证试验：用开启的内毒素指示剂固定于烤箱的冷点位置，设备按实际生产运行条件下操作，操作完毕取出内毒素指示剂，放置常温后制备成供试品溶液进行细菌内毒素检查，供试品溶液的结果用于判断隧道烘箱及干热烤箱干热灭菌除热原的有效性。

3 BET法在临床应用中的研究

3.1 输液器具及外科手术器材

BET法已广泛应用于临床一次性使用输液输血器具及外科手术器材等的检查。临床输液的全过程包括：大输液、输液管、配液注射器及输液中的其他药物。在给患者输液治疗中，如不严格操作，每个环节都有可能污染热原。刘守信等[15]就一般性感冒药物，生理盐水+青霉素+病毒唑为例，用细菌内毒素毒素定量仪对临床输液全过程进行质量监控的研究。祝清芬等[16]对眼部用药透明质酸钠眼内植入物的细菌内毒素检查进行了研究，将供试品的浸提液制成1 mg/ml试验对TAL无干扰。认为本品可建立BET法。

3.2 医用生物材料

热原检查是评价医用生物材料安全性重要指标之一。张逸等[17]采用PT法和BET法对粘克TM吸收医用膜72 h的浸提液样品进行对比检测，该浸提液原液用细菌内毒素检测不产生干扰，细菌内毒素试验结果为阴性，与家兔试验相符，符合医用生物材料的使用标准。认为可用BET法代替PT法。

3.3 临床中的辅助诊断

BET法在临床应用中作为辅助诊断，检查患者的血液、脑脊液等由革兰阴性菌产生的内毒素含量。透析法是尿毒症患者赖以生存的肾脏替代治疗，但透析液中内毒素有可能通过正常的透析膜进入血液的风险。高水平的内毒素可致热原反应、弥漫性血管内凝血、内毒素血症与休克等以至死亡，尤其对需要长期接受透析治疗的患者更容易出现。劳海燕等[18]用同体系模型动态比浊法定量测定血液透析浓缩液的细菌内毒素进行了研究，试验中定量添加标准内毒素，从中筛选出最佳的稀释倍数为40倍进行试验无干扰作用。认为此方法可以定量检测透析液中的细菌内毒素，从而保证临床用药的科学性和安全性。

4 BET 法的方法学研究

4.1 动态浊度法

熊向党[19]使用不同检测波长作动态浊度法细菌内毒素检查的比较。在405～660 nm波长处用动态仪对小牛血清及水解蛋白物注射液样品作动态比较内毒素检测。2种样品在不同波长动态仪测量内毒素含量RSD＜10%，所得结果与动态浊度法细菌内毒素检查一致。

4.2 特异性TAL

试验在最大有效稀释倍数下或用其他方法不能排除干扰的时候，如果选用特异性TAL试验，则为消除干扰提供了另一条途径。实验证实不含发热物质的葡聚糖能引起鲎试验呈阳性反应[20]。在用普通TAL和特异性TAL分别与不同浓度和相同浓度的含糖大输液进行凝胶试验时，含糖大输液比普通TAL凝胶试验阳性率高，而且糖浓度越高、装量越大，阳性反应率越高，且受取样位置的影响。

4.3 细菌内毒素快速检测试剂盒

熊向党[19]报道，通过制备细菌内毒素快速检测试剂盒，能使凝胶法的细菌内毒素检查的反应时间由常规法的60 min缩短至几分钟甚至更短。

4.4 显色基质TAL（终点法）

丁友玲等[21]采用显色基质TAL（终点法）测定BET水及有色药品中微量细菌内毒素。经检测多次高压灭菌的BET水中微量细菌内毒素、并进行了血卟啉注射液细菌内毒素回收试验。结果显示最低检测浓度可达0.001 5 EU/ml，细菌内毒素回收率分别为115.75%和115.00%。认为用显色基质TAL定量测定有色药品细菌内毒素含量可行。

4.5 凝胶法与光度测定法的比较

细菌内毒素检查法包括2种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。定量法（动态浊度法）与凝胶法相比，定量法的分析技术可最大限度地消除内毒素标准品对试验结果的影响。对一些组分复杂，干扰因素多的中药、生化药和生物制品注射剂可以选用定量法试验，如三磷酸腺苷二钠注射液[22]稀释50～400倍，金叶败毒注射液[23]稀释100倍，采用动态比浊法试验，极微量的内毒素都能检出，同时能有效地消除对TAL的干扰。

5 结语

细菌内毒素检查在药品检验、制药工艺及临床医学应用方面是一项重要的质控技术，许多国家的药典收载了这一方法，家兔检查热原的方法因其难以标准化而使越来越多品种的热原检查项被BET法所取代，原对热原检查未作要求的品种也逐步建立起细菌内毒素的检查方法。在对药品的检验方面，美国药典第25版已有627个药品品种规定用BET法检查热原，而我国用于制备注射制剂的原料药和相当多的注射用制剂没有建立BET法。如注射用琥珀氯霉素无菌粉末及其原料药，有些2种作用相似的药品如注射用硫酸长春新碱规定做细菌内毒素检查，而注射用硫酸长春碱却未要求。《中国药典》2005年版二部（化学药品）在8种维生素类注射液中，只有维生素C注射液规定做细菌内毒素检查，而在临床用药中，常常会将供肌内注射的药品加入到输液中进行静脉给药。笔者认为，在扩大药品品种的应用研究方面，我国的药学工作者还有大量的工作要做。

目前，在我国对细菌内毒素检查的应用研究多数采用凝胶限量法试验。细菌内毒素定量法技术可为供试品提供更大倍数的稀释，极微量的细菌内毒素都能检出，能更好地消除在实验中带来的干扰。在国外，细菌内毒素定量法的使用率已达65%～70%[24]，超过凝胶法，表明我国细菌内毒素定量技术与国际间差距较大。因此，我们应重视细菌内毒素定量技术的应用与研究。

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