活性氧在细菌耐抗生素机制中的作用

张亚妮，段康民

(西北大学生命科学学院，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西西安710069)

活性氧在细菌耐抗生素机制中的作用

张亚妮，段康民

(西北大学生命科学学院，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西西安710069)

细菌对抗生素的耐药性以惊人的速度蔓延，阐明抗生素导致细菌死亡内在机制，对提高抗生素药效以及寻找新型抗生素显得尤为迫切。近期研究表明，抗生素引起的细菌内活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)产生，是导致细菌细胞死亡的关键原因。该文对ROS、SOS和细菌耐药性方面的最新研究进行了综述和探讨，为开发新型抗菌药物，遏制细菌感染和耐药性提供新的思路。

抗生素;耐药性;活性氧;SOS;损伤负荷;损伤修复

面对越来越多耐药细菌的出现和抗生素资源渐渐枯竭的双重危机，寻找新型抗生素，必须要转移到在细菌的应激反应和防御系统中寻找切入点，这样才能有望遏制细菌的耐药性。细菌对抗生素产生耐药性主要是由其遗传物质的变化引起，包括遗传物质转移(质粒的接合、噬菌体转导、水平基因的转移)，潜在的可动遗传因子(mobile genetic elements)激活(转座子或隐蔽基因)，以及自身DNA的突变［1］。这些有可能是由于细菌染色体直接和抗生素之间相互作用的结果，也可能是由于抗生素引起的活性氧物质导致产生的，或者是细菌中的差错修复系统在修复DNA损害时形成的［2］。以上方面可能是细菌改变和逃避抗生素抑杀的新机制，也是在治疗细菌感染时一直忽略的方面。目前研究表明，细菌面对抗生素时生理应答引起的氧化压力升高，ROS过量产生，是导致细菌遗传物质变化的主要因素［3－4］。这种生理应答包括SOS DNA损伤应答［5－6］、热休克蛋白应答［7］、氧化压力应答［8－9］。本文中，我们将讨论抗生素怎样造成细菌内氧化压力，以及ROS在细菌耐药机制中的作用。

1 抗生素诱导细菌ROS的形成

越来越多的证据表明［10－11］，抗生素的存在可引起细菌内氧化压力升高，ROS过量产生，是导致细菌细胞死亡的关键原因。ROS是生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称，主要有超氧阴离子、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)、一氧化氮(NO)等。正常情况下，细胞内ROS的产生和清除是平衡的，随着ROS的过量产生或受其它环境胁迫时，细胞中的氧化还原平衡即偏向氧化的一边，此种不平衡的状态就会形成氧化压力(oxidative stress)［12］。ROS处于较不稳定的状态，其反应活性较非自由基高，易与其它分子发生反应［13］。造成细胞膜脂质过氧化、蛋白质及DNA的伤害，其中以DNA的伤害最为严重。

为了证明细菌细胞的死亡与ROS直接相关，研究针对不同细菌细胞靶位的抗生素所带来的影响。这些抗生素包括:氟喹诺酮类抗生素(作用靶位是拓扑异构酶)、氨基糖苷类抗生素(作用靶位是核糖体)、β-内酰胺类(作用靶位是肽聚糖合成)。当用革兰阴性杆菌(大肠埃希菌)和革兰阳性球菌(金黄色葡萄球菌)测试时，所有三类抗生素都诱导细菌细胞中产生·OH［9］。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种广泛存在于生物体中一种非常重要防御氧化损伤的金属酶，它在维持生物体内的产生与消除的动态平衡中起重要作用。SOD可催化发生歧化反应，从而清除但研究发现氟喹诺酮类药物可以抑制大肠埃希菌中SodA和SodB酶活性，β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素可以抑制AhpC酶(氢过氧化物还原酶)活性［14］。因此，Dwyers等［2］认为杀菌抗生素诱导细菌死亡途径中可能存在着一个由OH·介导的共同反应机制。

2 细菌的损伤修复

细菌可通过多种途径对ROS引起的DNA损伤进行修复［15］。SOS应答是DNA受到损伤或复制受阻时的一种诱导反应，在大肠埃希菌中，这种反应由recA-lexA系统调控，正常情况下处于不活动状态。当有诱导信号如DNA损伤或复制受阻形成暴露的单链时，recA蛋白的蛋白酶活力就会被激活，分解阻遏物lexA蛋白，使SOS反应有关的基因去阻遏而先后开放，产生一系列细胞效应。引起SOS反应的信号消除后，recA蛋白的蛋白酶活力丧失，lexA蛋白又重新发挥阻遏作用。SOS反应中易出错多聚酶的表达是细菌发生突变并产生抗性的关键原因，认为只要关闭SOS系统，即阻止了过度进化，就能防止级联突变的发生。正是这种级联突变，使大肠埃希菌产生了对抗生素的耐药性。环丙沙星会引起lexA蛋白的剪切，细菌的SOS应答，从而诱发细菌迅速产生耐药性［16－17］。

在细菌细胞中DNA损伤并不总是被除去，当损伤负荷(lesion burden)超过细胞修复机制所能承受的能力或损伤本身不能被其修复途径识别、修复时，一些DNA损伤会在基因组上暂时保留下来，而带有大量未修复损伤的细胞照样能进行DNA复制及分裂，这就是DNA的跨损伤合成(translesionsynthesis，TLS)，通常又被称为损伤旁路(damage bypass)，正是这种跨损伤合成系统的存在使DNA复制受阻恢复，细胞周期继续，细胞耐受其DNA损伤，降低了细胞对各种DNA损伤因素包括电离辐射杀细胞效应的敏感性，其后果往往是使细胞更易于发生突变。

在大肠埃希菌中，损伤诱导的突变由SOS反应诱导产生的DNA聚合酶Ⅴ(polⅤ、umuC和umuD基因编码)来完成［18，19］。在SSB、RecA存在下，polⅤ的跨损伤合成能力增强，导致SOS定标性突变(SOS targeted mutagenesis)。当复制未损伤的DNA时，polⅤ也表现出高突变性并且易形成嘌呤或嘌呤、嘧啶或嘧啶错配，导致SOS非定标性突变(SOS nontargeted mutagenesis)［20］。SOS反应还启动dinB基因，编码polⅣ，polⅣ缺少3'→5'外切酶活性，是低保真度聚合酶，缺乏3'→5'校读外切核酸酶活性，能以严格分布方式(strictly distributive manner)和延伸鼓出的(bulged)引物/模板结构、错配的引物/模板能形成滑移中间体(slipped intermediate)［20］。最近的研究结果［19，21－22］发现polⅣ可能是细菌在各种代谢应激条件下引发全基因组范围突变的主要候选酶。

3 ROS引起的细菌遗传物质突变

当细菌处于极端逆境下时，它们会尝试各种方式，将受到的损伤作为突变的初始步骤。然后，它们开启一些基因，这些基因表达的蛋白会加速突变的发生，这类突变的产生速度，比细胞复制期间产生突变的速度要快1万倍。实质上，这些细胞经受了一种迅速的身份转变。例如，大肠埃希杆菌通过发出SOS，对环丙沙星和其他抗生素造成的持久性DNA损伤作出应答。发生的突变阻止环丙沙星结合其靶标——促旋酶，因为促旋酶是DNA复制所必需的。如果细菌不能阻止环丙沙星与促旋酶结合，那么细菌的DNA就不能正常复制，以致断裂，接着细菌就会死亡。

DNA氧化损伤产物主要有8-氧-脱氧鸟苷(8-oxodG)和2-羟基腺苷(2-OH-A)，其中8-xodG稳定，是最重要的产物。在细菌体内，8-oxodG引起DNA损伤的机制可以使模板链中鸟嘌呤(G)的直接氧化，也可以使核苷酸池中游离鸟苷氧化，DNA聚合酶与8-oxodG:A的结合效率不比正常的G:C配对效率差，因此，如果8-oxodG:C不能得到及时修复，在复制中8-xodG易与A错配，导致G:C→A:T的碱基颠换，从而引起相关基因功能的改变［23］。目前认为，碱基切除修复系统(base excision repair，BER)在抗氧化损伤中发挥主要作用，可将氧化的核苷酸前体物或碱基移除，明显降低8-oxodG的致突变作用，使错误碱基不至于结合进入DNA的复制产物中，进而提高基因的稳定性［24］。在细菌体内，BER修复酶基因主要有3种:MutT、MutM、MutY。MutT是1个核苷三磷酸解酶，将氧化的鸟嘌呤腺苷三磷酸(8-oxodGTP)降解为氧化的鸟嘌呤腺苷单磷酸(8-oxodGMP)，这样单磷酸的核苷酸即无法在复制时进入基因中，避免因氧化的碱基而造成错配的发生［25－26］。MutM则是利用它的糖基化酶活性(glycosylase)，从8-oxodG:C的配对中移除8-oxodG，并利用AP裂解酶活性(AP lyase)使DNA中的嘌呤碱基开环，进而形成AP位点，接着再行修复成为完整的G:C配对。当8-oxodG:C的累积超过MutM的修复时，则过多的8-oxodG:C会产生8-oxodG:A错配。此时若不经修复，在DNA复制时将造成永久性的错配，因此需另1种蛋白质参与修复，即MutY。MutY是一种腺嘌呤糖基酶(adenine glycosylase)，移除与8-oxodG: A碱基错配中的腺嘌呤，而形成AP位点。当腺嘌呤移除后，MutY会确认8-oxodG与胞嘧啶形成8-oxodG:C配对后，使得MutM有第2次的机会可以修复移除氧化的碱基8-oxodG［27－28］。

4 总结

抗菌药物为人类的健康生存和发展作出了巨大的贡献，然而随后出现的细菌耐药性问题已经发展到了非常严重的地步，深入了解抗生素的作用机制及其相关的耐药机制对研制新的有效的抗菌药物是非常必需的。

将抗生素的耐药性与因ROS引起的细菌对大分子破坏SOS反应、DNA易误复制相关联的数据正不断增多，这些数据可用来开发新的抗菌药物。在以前确定新抗生素新靶标的工作中，可能没注意到这些反应中的网络关系，因为它们对细胞生长一般是非必需的。通过抑制这个网络途径的化合物获得研制抗生素新概念，同时对统治药物开发的“一个化合物对一个靶标”的概念是一种重要的变通方法。尽管这种开发抗生素的方式面临着各方面的挑战，但应注意到，这可能是抑制细菌感染的另一有效策略。

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Role of reactive oxygen species in mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria

ZHANG Ya-ni，DUAN Kang-min
(Key Laboratory for Biological Resources and Modern Biotechnology of West China，College of Life Sciences，Northwest University，Xi'an710069，China)

Antibiotic resistance has been spreading at an alarming rate among pathogens，which poses a great threat to human health．It is critical to investigate the mechanisms of action of antibiotics in order to develop new antibiotics and enhance the efficacy of the existing ones．Recent studies indicate bactericidal antibiotics kill pathogens via a common pathway involving reactive oxygen species(ROS)．In this review，the recent progress in the interplay of ROS，SOS and antibiotic resistance has been discussed．These data should prove to be of importance for the development of new antibiotic strategies and encountering with pathogen drug resistance．

antibiotic;drug resistance;reactive oxygen species;SOS;lesion burden;repair damage

R-05;R 378;R 978．1

A

1001－1978(2010)09－1129－03

2010－05－20，

2010－06－21

国家自然科学基金资助项目(No 30870097);2010年陕西省自然科学基金资助项目(No 2010JQ4023);2010年陕西省教育厅科学研究项目

张亚妮(1975－)，女，博士，研究方向:细菌的耐药性，Tel: 029-88302411，E-mail:yani@nwu．edu．cn;段康民(1962－)，男，教授，博士生导师，研究方向:病源菌的致病性和新型抗生素研究，Tel:029-88305288，E-mail:kduan@nwu．edu．cn