小檗碱与芒果苷及其配伍对L6成纤维细胞葡萄糖摄取的影响及机制

吴 巍，滕厚雷

(海南德泽药物研究有限公司，海南海口 570105)

小檗碱与芒果苷皆为来源于植物的天然产物，具有抗糖尿病等多种药理活性。李学坚等［1－3］曾报道小檗碱与芒果苷配伍具有抗炎、抑菌、镇痛、降糖的药理活性，但二者配伍后在细胞水平的研究尚未见报道。该文以葡萄糖摄取为切入点，观察二者配伍对葡萄糖摄取的影响，并进而研究二者配伍对葡萄糖摄取信号通路的影响。以期为进一步评价二者配伍在治疗糖尿病方面的意义提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 芒果苷、盐酸小檗碱，经HPLC鉴定二者纯度＞98%;小檗碱配伍芒果苷(将盐酸小檗碱与芒果苷以摩尔比1∶1配伍，简称BM):海南德泽药物研究有限公司自制。

大鼠 L6成纤维细胞(简称 L6细胞，ATCC)、HGDMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、2-脱氧葡萄糖(Sigma)、［3H］-2-脱氧葡萄糖(Amersham Pharmacia);AMPK磷酸化抗体(Thr172)、AMPK本底抗体、ACC磷酸化抗体(Ser79)均购自Cell Signaling公司。

1.2 实验方法

1.2.1 L6细胞培养及分化 置于37℃、5%CO2的培养箱中，用HG-DMEM培养基培养。

1.2.2 2-脱氧葡萄糖摄取 L6细胞在无血清的HG-DMEM培养基中饥饿2 h。化合物以不同的浓度梯度加到培养基中孵育2.5 h，然后更换含有化合物的 HBS溶液，以1 μmol·L－1的胰岛素作为阳性对照，再孵育0.5 h。加入终浓度为0.1 mmol·L－1的二位脱氧葡萄糖和 1.85 ×107Bq·L－1的二位3H同位素标记的二位脱氧葡萄糖，用Microbeta仪器闪烁计数。测细胞裂解液的总蛋白浓度来定细胞数量。以空白对照孔的葡萄糖吸收数值为100%，计算化合物孔及阳性对照孔的葡萄糖吸收百分比。

将芒果苷、小檗碱及BM与阳性对照胰岛素的数据相比所得的各受试物与胰岛素的相对效力比作为评价指标，以平行对比芒果苷、小檗碱及BM对糖摄取的影响。

1.2.3 免疫印迹检测AMPK磷酸化水平 L6细胞在无血清的HG-DMEM培养基中饥饿3 h。化合物以不同的浓度梯度加到培养基中孵育2～3 h，收样。SDS-PAGE转膜，再分别与抗 AMPK-p、AMPK、ACC-p、β-actin的一抗 4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，分别加二抗，室温孵育1 h，洗膜3次，最后用ECL底物显影曝光。

1.3 统计学处理 组间比较采用SPSS 13.0软件进行方差分析或t检验。

2 结果

2.1 小檗碱与芒果苷配伍对L6细胞糖摄取的影响 0.625 μmol·L－1浓度下，BM、小檗碱、芒果苷与胰岛素的相对效力比分别为(91.26±13.28)%、(61.34±6.08)%、(51.45±7.94)%;BM与小檗碱比差异有显著性(P＜0.05)，与芒果苷比差异有显著性(P＜0.01)。

1.25 μmol·L－1浓度下，BM、小檗碱、芒果苷与胰岛素的相对效力比分别为(101.06±4.57)%、(70.77±6.43)%、(52.85±8.09)%;BM与小檗碱比差异有显著性(P＜0.01)，与芒果苷比差异有显著性(P＜0.01)。

2.5 μmol·L－1浓度下，BM、小檗碱、芒果苷与胰岛素的相对效力比分别为(102.13±4.77)%、(91.04±9.58)%、(49.30±5.47)%;BM与小檗碱比差异无显著性(P＞0.05)，与芒果苷比差异有显著性(P＜0.01)。

5 μmol·L－1浓度下，BM、小檗碱、芒果苷与胰岛素的相对效力比分别为(120.47±12.48)%、(98.66±4.19)%、(49.32±2.20)%;BM与小檗碱比差异有显著性(P＜0.05)，与芒果苷比差异有显著性(P＜0.01)。

试验结果表明:BM与小檗碱均能促进L6细胞的葡萄糖摄取，但芒果苷未表现出促葡萄糖摄取作用。BM与芒果苷、小檗碱比较，活性增强，表明芒果苷与小檗碱配伍具有协同作用。

2.2 小檗碱与芒果苷配伍对L6细胞AMPK与ACC磷酸化水平的影响 1.25、2.5、5.0 μmol·L－1BM 能提高 L6 细胞AMPK及其下游底物ACC的磷酸化水平，呈浓度依赖性。2.5、5.0、10 μmol·L－1小檗碱能提高 L6 细胞 AMPK 及 ACC的磷酸化水平，呈浓度依赖性。1.0、2.0 μmol·L－1芒果苷未能提高L6细胞AMPK及ACC的磷酸化水平，4.0 μmol·L－1芒果苷能提高L6细胞AMPK的磷酸化水平，但未能明显提高ACC的磷酸化水平。

3 讨论

文献报道小檗碱、芒果苷可以促进L6成纤维细胞的葡萄糖摄取，机制是通过激活AMPK信号通路，增加GLUT的表达与转位，从而促进细胞对葡萄糖的摄取［4～7］。

我们的研究结果亦表明小檗碱、芒果苷可以促进AMPK磷酸化，小檗碱可以促L6细胞葡萄糖摄取，但芒果苷却未表现出促葡萄糖摄取作用。此项研究结果的不同，是否与实验方法不同有关，尚有待进一步研究。

在葡萄糖摄取试验中，小檗碱与芒果苷配伍后表现出优于各单体的活性作用，表明二者配伍具有协同作用。为揭示小檗碱与芒果苷的配伍意义，以进一步将小檗碱与芒果苷配伍开发为新药提供实验依据。

AMPK是一种异源三聚体蛋白，被称为细胞的“代谢感受器”。AMPK的活化能够调节葡萄糖和脂类代谢，抑制胰岛素抵抗，对2型糖尿病患者骨骼肌和肝脏具有明显的保护作用。因此，AMPK及其信号通路极有可能作为研发新型抗2型糖尿病药物有效的药理学靶点［8］。因此，寻找激活AMPK的小分子药物，将是未来治疗2型糖尿病可能的途径。

小檗碱与芒果苷配伍，可明显促进L6细胞的葡萄糖摄取与AMPK磷酸化。说明小檗碱与芒果苷配伍是通过激活AMPK信号通路发挥促葡萄糖摄取作用的。此研究结果为将小檗碱与芒果苷配伍的新药开发为AMPK激动剂提供实验依据。

(致谢:感谢中科院上海药物研究所国家新药筛选中心李静雅博士、李佳博士、张薇博士给予的技术支持。)

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