肺成纤维细胞在肺纤维化进程中的作用

高 建，刘 干，李 俊

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种严重的肺间质疾病，其发生的主要病理特点是早期的弥漫性肺泡炎，后期大量成纤维细胞病理性增殖转型及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)进行性异常积聚并取代正常的肺组织结构［1］，实质是肺泡损伤，肺组织过度修复，异常重塑的过程。其发病原因很多，如病原微生物、粉尘、药物、化学制剂等多种因素均可诱导产生肺纤维化［2-3］。统计资料显示其5年生存率低于50%，10年生存率约30%，目前尚缺乏有效防治手段，因此寻找防治肺纤维化有效药物，一直是国内外药物研究的热点［4］。肺纤维化肺纤维化过程中，成纤维细胞(fibroblast，FB)扮演着极为重要的角色，本文就FB在肺纤维化过程中所发挥的作用及机制作一综述，从而进一步探讨更为明确的发病机制，寻求更多的药物作用靶点，为肺纤维化的治疗治疗提供新思路。

1 成纤维细胞的形态结构与功能

生理条件下，成纤维细胞是肺脏结缔组织中主要的细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来，其形态多样，大多呈梭形、多角形和扁平星形等，具有突起。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松色浅，核仁明显。其形态可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，提示它具有合成和分泌蛋白质和胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质的功能。但成纤维细胞的早期，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体退化，这一阶段通常称之为纤维细胞(fibrocyte)。在特殊情况下，纤维细胞可以重新转变为成纤维细胞状态而发挥相关作用［5］。生理条件下，FB的主要功能包括:构造和维持肺脏的正常形态，合成和释放ECM，为肺组织和细胞的高效交换气体提供物质基础，构成肺组织的主要支架，维持肺上皮和内皮细胞正常生理作用，以及组织损伤后及时大量聚集修复损伤组织。病理条件下，FB主要是通过自身的异常增殖与转型以及大量分泌ECM两个方面参与肺纤维化进程。

2 肺成纤维细胞异常增殖转型直接触发PF

肺纤维化过程中，多种因素的共同影响，尤其是大量细胞因子的刺激作用，会使FB不断地增殖和转型为肌成纤维细胞(myofibroblast，MB)。其中最为关键的因素是转化生长因子 β(transforming growth factors-β，TGF-β)。它是目前认为的致纤维化作用最强的细胞因子之一，它们通过与相应的受体结合，刺激成纤维细胞增殖并诱导其向MB转化［6-7］。MB是一种特殊阶段的FB，能够大量分泌ECM，分泌能力是FB的4～5倍。其与FB的主要区别在于是否明显表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)［8］。提示α-SMA可作为肌成纤维细胞的标示物之一。但有的学者［9］提出，活化转型的MB中并不是全部高表达α-SMA这提示单一依靠检测α-SMA来衡量FB的转型程度可能会出现假阳性的结果。随着FB数目的不断增加，肺部的成纤维灶逐渐形成，并且逐渐取代正常的肺细胞组织，引起肺部结构的异常重塑，进而触发PF。这一过程是FB参与PF的重要方面之一。需要注意的是，尽管FB的增殖转型是成纤维细胞灶的主要来源，但近年的研究表明［10］，在肺纤维化过程中部分成纤维细胞灶的细胞可能由其他肺部细胞转化而来，并有作者提出“上皮-间质转分化”(epithelial-mesenchy-mal transition，EMT)这一概念，认为肺泡上皮细胞向间质细胞转化是纤维化过程中局部成纤维细胞的重要来源之一。Iwano等［11］通过研究肾间质纤维化机制发现肾间质纤维化状态下的肾成纤维细胞约42%来源于肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cell，RTEC)的转化。此外，体外研究表明Ⅰ型胶原(collagen-Ⅰ，COLⅠ)可促使RTEC形态改变，主要表现为细胞变大，两端出现类似肾成纤维细胞极性，产生突起，细胞间的紧密连接消失。免疫组化则显示肾成纤维细胞特异蛋白-1(+)、RTEC角蛋白(-)［12］。提示Ⅰ型胶原可以促进RTEC通过EMT方式转化为肾成纤维细胞。另外其他体外实验证明TGF-β1刺激的大鼠原代肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cell，AEC)的间质细胞标记物(α-SMA、COL-Ⅰ)表达上调，同时上皮细胞标记物(水通道25、细胞角蛋白)表达下调，同时其形态也向纤维细胞样转变［12-14］。提示部分AEC在肺纤维化过程中向FB转化是成纤维细胞灶细胞的来源之一。EMT发生过程中，β-连环蛋白信号在肺纤维组织修复过程中有着诱导上皮细胞向间质细胞转换的作用［15］。EMT的转分化方式可能与多条信号转导通路有关，Ras、Rho、Src、Smads等信号转导通路均参与EMT过程的调控，每个信号通路活化各自的核内转录因子，最终调节靶向基因的表达，介导 EMT的发生［16-17］。近来研究表明［18］，通过给于肺纤维化大鼠吸入NO，可以明显减少肺成纤维细胞的数量，减轻肺纤维化症状。表明NO对于上皮细胞的功能的调节机制可能是对抗肺纤维化的一个潜在的靶点。

FB触发PF的过程中，众多细胞因子对FB的增殖转型起着重要的调控作用。生理条件下，正性调节因子与负性调节因子趋于平衡，保证了FB的正常增殖与凋亡。但在PF中，由于正性调节因子的大量释放，而负性调节因子的分泌遭到抑制，导致细胞因子网络平衡失调，FB大量异常增殖转型进而触发PF。这也提示我们是否可以增加负性调节因子活力，诱导成细胞胞凋亡来对抗FB的进展?Hadden等［19］研究FB的凋亡信号转导途径发现RGD、CS-1和FN-C/H-V 3种可溶性纤维多肽能够诱导肺成纤维细胞凋亡，其机制可能是阻碍了由整合素介导的细胞生存信号通路及相关的生物学效应，如抑制了细胞黏附、基质金属蛋白酶、某些致炎因子和抗炎因子的表达，从而调节程序性细胞死亡。

3 肺成纤维化细胞大量分泌细胞外基质直接触发PF

ECM是指分布于细胞膜的细胞外空间，由细胞分泌的蛋白和多糖所构成的网状结构，主要由胶原蛋白、纤维连接蛋白、透明质酸、蛋白聚糖等成分构成。在正常肺组织中，胶原蛋白是肺组织的主要ECM，约占肺脏干重的1/5，而在这些胶原蛋白中，以Ⅰ型和Ⅲ胶原蛋白为主。基质金属蛋白酶(MMPs)是分解细胞外基质的主要酶类，基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMPS)则特异性的抑制MMPs对ECM的分解作用。MMPs/TIMPS系统是控制ECM代谢平衡的关键系统。生理情况下，肺内胶原的合成与降解处于平衡状态［20］。但在肺纤维化过程中，MMPs/TIMPS系统平衡被破坏，产生以FB大量分泌ECM，ECM过度聚集为特征的紊乱现象。这种紊乱的重要原因之一在于多种细胞因子刺激FB的转型为MB，进而大量分泌胶原蛋白，导致大量的ECM异常聚集。国内外研究表明众多细胞因子在促进FB大量合成释放ECM的过程中起着重要的调节作用。有学者甚至认为［21］肺纤维化是由多种细胞因子启动并维持的胶原蛋白失调的结果。TGF-β促进ECM聚集主要是通过Smads介导的信号转导通路来实现的。研究发现Smad3敲除小鼠表现出的纤维化损伤比野生型小，Ⅰ型胶原mRNA及纤维连接蛋白mRNA和蛋白的表达量也比野生型的少。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)则是 TGF-β 发挥作用的下游效应介质，报道表明，在人胚肺成纤维细胞中，CTGF可通过PI3K/PKB信号转导和转录激活子3信号通路，促进肺成纤维细胞转型，另外还可能通过抑制p27Kip1的表达，上调cyclinD1而诱导细胞转型而大量分泌ECM［22］。因此有人考虑通过阻断CTGF的信号转导通路来达到拮抗PF进展的目的，其中脂氧素A4(lipoxinA4，LXA4)可阻断以上信号通路，实验表明表达转染LXA4受体样蛋白基因可以加强LXA4对CTGF诱导成纤维细胞增殖转型的抑制效应［23］。Hashimot等［24］证实IL-4和IL-13可通过JNK途径促使FB向MB转化。另外血小板源性生长因子(PDGF)可通过与PDGF受体结合，对成纤维细胞产生强烈趋化作用和致有丝分裂作用，有效刺激成纤维细胞转型增殖，并能诱导血管生成，进而刺激ECM的合成［25］。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migrationinhibitory factor，MIF)则通过促进 TGF-β1的表达，从而间接促进FB大量分泌ECM。目前认为MIF主要通过激活Rho激酶途径来实现这种促进作用［26］。胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF)可以与胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)结合，不仅能够直接促进细胞增殖转型，释放大量ECM，还可以加强TGF-β、PDGF等其它致纤维化因子的致纤维化作用来参与PF［27］。总之，在多种细胞因子的共同刺激下，FB转型分化为MB，大量分泌ECM，同时由于MMPs/TIMPS系统平衡被破坏，导致ECM异常聚集，这是FB其参与PF进程的另一重要方面之一。

4 肺成纤维细胞作用于其他细胞间接触发PF

肺纤维过程中，除了FB通过自身的增殖转型形成成纤维细胞灶和大量分泌ECM来参与肺纤维化进展外，FB还可以作用于一些其他的细胞或者刺激自身而间接参与PF。

4.1 肺成纤维细胞作用肺泡上皮细胞触发PF 肺泡上皮细胞(AEC)分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型AEC的功能主要是维持肺泡结构，在其受到损伤凋亡后，AECⅠ可以迅速增殖、分化来进行补充与修复。Ⅱ型AEC是肺泡上皮的干细胞，具有无限增殖的潜能［28］，其中参与肺纤维化的主要是AECⅡ。FB作用于AECⅡ间接参与PF主要是通过两个途径来实现:①受多种因素影响，分泌维持AECⅡ正常生长与修复的物质的功能被破坏，导致AECⅡ受损。② 分泌TGF-β诱导部分AECⅡ向成纤维细胞转化来参与PF。

一直以来，大家主要关注于肺纤维化的始发阶段——肺泡上皮损伤，研究这一阶段所导致的后续效应:FB的异常增殖转型以及一系列炎症反应。但很少研究FB的异常增殖转型是否可以反向促进AECⅡ的损伤而产生恶性循环加快PF的进展?目前认为生理条件下FB通过分泌肺泡表面活性物质来维持AECⅡ的正常生长与修复和抑制其转型［29］。实验表明加入FB上清液的AECⅡ组7 d和28 d时Ⅱ型肺泡表面活性物质相关蛋白A(SP-A)mRNA和肝细胞因子(HGF)mRNA均比照组低，且7 d和28 d时SP-A和HGF的表达无明显差异，提示在肺纤维化过程中，FB正常分泌SPA和HGF来维持AECⅡ正常修复生理功能可能已经被破坏，而随着时间的变化，指标并没有明显的差异则可能意味AECⅡ的自我修复功能已经丧失［30］。这些都显示在肺纤维化过程中，FB可以抑制AECⅡ的修复功能，促进AECⅡ的损伤，加快PF进展。其他研究也得出了类似的结论:从IPF患者分离出的成纤维细胞和肌成纤维细胞可以促进AEC损伤凋亡［31］，损伤后的AECⅡ主要通过表达一系列参与成纤维细胞移行、增殖、转分化和ECM重构的分子，如MMPs，趋化因子和多种致纤维化因子等来促进PF。其中MMP-2和MMP-9可降解肺泡壁ECM和基底膜中几乎所有的蛋白成分，导致AECⅡ损伤后的修复时间延长，使成纤维细胞、炎症细胞趁机侵入肺间质并增殖，触发PF。

目前认为TGF-β主要来自于肺泡巨噬细胞的分泌，但在PF过程中，FB也可分泌 TGF-β来参与肺纤维化。Xu等［32］也发现，接受TGF-β1处理后的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞株上调α-SMA和波纹蛋白的表达，而下调上皮细胞标记物上皮钙粘附素和细胞角蛋白-19的表达，且细胞伸长变形为纤维样细胞。这提示我们在肺纤维化中，FB可能还可通过自分泌TGF-β诱导部分AEC转化为FB，使之成为成纤维细胞灶的来源之一，参与PF。

4.2 肺成纤维细胞作用于炎症细胞参与PF PF过程中，活化的FB可以通过分泌多种炎性因子来刺激炎症细胞，主要有 IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、内皮素-1(ET-1)等。IL-1和IL-6主要通过趋化炎症细胞聚集，促进炎症细胞侵润，加快肺纤维化早期阶段——肺泡炎症的进展，进而介导PF的发生。其中IL-1还可以上调黏附分子分泌，促使白细胞进入肺间质促进炎症反应。TNF-α则上调黏附分子和化学趋化分子，与IL-1一起激活中性粒细胞，介导肺泡炎症反应。ET-1是一个很重要的前炎症因子，它可刺激肺部花生四烯酸1，5-脂氧化酶活力和氧自由基(ROS)生成，刺激中性粒细胞释放弹性蛋白酶，激活肥大细胞，并且诱导单核细胞产生ROS、前列腺素E、白三烯、蛋白酶等释放而加重肺泡炎症。ET-1还可改变多形核中性粒细胞(PMN)的变形能力，促进它们在肺内的潴留。在ET-1诱导作用下，PMN细胞内游离的G-肌动蛋白迅速排列纤维成为细丝状的F-肌动蛋白，降低了细胞变形能力。这一变形能力可被NO的供体硝普钠(SNP)抑制［33］。在卵白蛋白致敏的小鼠实验中，ET-1受体拮抗剂BQ-123和SB209670使支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞数目分别降低了47%和68%，它们均能抑制中性粒细胞在肺中的浸润［34］。表明ET-1能促进炎症细胞在肺部的浸润。总之，FB还可以通过分泌某些炎性因子来刺激炎症细胞，加重肺泡炎性损伤参与PF。

4.3 肺成纤维细胞刺激自身参与PF 在肺纤维的发生过程中，FB可以自己分泌一些与纤维化相关的细胞因子直接加速PF的进程。比如，分泌的TGF-β、PDGF等可以直接促进自身的增殖转型，促使FB大量分泌ECM。尤其是转型后的肌成纤维细胞还可高表达MMP-9来降解基膜的蛋白，为FB的移行创造条件。

5 结语

肺成纤维细胞作为肺纤维化过程中至关重要的细胞之一，其异常转型增殖形成肺成纤维细胞灶和大量分泌ECM，介导ECM的大量沉积是PF过程中关键事件，是PF进展的重要原因。此外FB还可以通过作用于肺泡上皮细胞和一些炎性细胞或间接参与PF。鉴于FB在PF的重要作用，因此有关肺成纤维细胞在PF中发挥作用的更多机制需要我们来探讨。近年来，由于多种细胞因子因具有强烈致纤维化作用，已被广泛用于体外肺纤维化模型的研究。但目前大都局限于研究单一细胞因子的刺激作用。PF中是否存在多种细胞因子相互促进而放大这种致纤维化作用?能否利用这种放大作用来建立一种更为优越的体外肺纤维化模型?这将是我们下一步工作的目标。

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