大肠杆菌表达系统的影响因素

许崇利，杨 梅，许崇波

（1.吉林化工学院环境与生物工程学院，吉林吉林 132022；2.大连大学医学院，辽宁大连 116622）

随着世界分子生物学研究不断深入。基因表达技术有了很大的提高。迄今为止，人们已经研究开发出多种原核和真核表达系统用以生产外源蛋白。在各种表达系统中，其中大肠杆菌表达系统因其遗传背景清楚，低成本，高生产率，特征明确，兼容多种抗体使之成为目前最常用的外源蛋白原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等。因此本文将就外源基因本身特性和表达系统的特性及其他因素等方面阐明外源基因高效表达的影响因素，从而为大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白提供参考。

1 外源基因本身的特性对表达的影响

1.1 外源基因结构

外源基因包括原核基因和真核基因两大类。其中原核基因可以在大肠杆菌中直接表达，而真核基因与原核基因不同，它是断裂基因，基因组DNA中的基因是不连续的，含有内含子序列，大肠杆菌对转录出的前体mRNA不能进行剪切形成有功能的mRNA，故不能在大肠杆菌中直接表达，而只能以cDNA的形式在大肠杆菌中表达[1-2]。而且由于真核转录和翻译元件不能为大肠杆菌识别，必须提供大肠杆菌识别的转录及翻译元件以保证真核基因的表达。如真核基因的前导肽不能被大肠杆菌识别发生正确的剪切，因此在设计真核基因时应去除前导肽序列，必要时换以原核的信号肽序列。真核基因产物除带有前导肽外，许多蛋白质都是以无活性的前体蛋白的形式表达，通过翻译后的加工才能成为活性状态，因此在设计基因时应从活性蛋白质编码序列开始[3-5]。

1.2 外源基因密码子的选择使用

原核生物中，由于不同tRNA含量上的差异产生了对密码子的偏爱性。经统计发现：AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC8种密码子是大肠杆菌的稀有密码子[6]。蛋白翻译过程中，如果稀少密码子连续出现，会抑制蛋白质合成，发生密码子错配[7]。因此对含较高比例稀有密码子的外源基因进行表达时，应针对密码子的偏爱性采取措施，如用非连续性多核苷酸定点突变方法对cDNA中稀有密码子进行同义突变，或提高某种氨基酸的tRNA浓度。G Srimivasan[8]等报道Methanosarcina barkeri甲胺转甲基酶基因中UAG密码子编码了一个赖氨酸衍生物，故在重组蛋白表达时应避免使用UAG作终止密码子，防止转录过程的通读。已知大肠杆菌格外偏爱终止密码子UAA，尤其当在其下游连上一个U而形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率会进一步加强[9]。

1.3 RNA的一级与二级结构的影响

外源基因转录出的mRNA一级与二级结构与外源蛋白的合成有很大关系，也是影响表达效率的重要因素之一[10]。mRNA一级结构对翻译效率的影响已有较多研究。转录出的mRNA 5′上游的SD序列与ATG之间的碱基数目和碱基组成对目的基因的翻译效率也很重要。有报道[11]认为，间距以6~11个碱基为最好，而碱基组成以C+G比例不超过50%为好。影响外源基因在大肠杆菌中表达的另一个因素是翻译起始区（TIR）的二级结构，TIR指一切与翻译起始有关的顺式序列，包括RBS及其它参与二级结构形成并影响翻译的序列。降低TIR二级结构稳定性可以提高翻译起始效率，提高mRNA稳定性，有利于外源基因表达[12]。沈芸等[13]通过改变原有载体的TIR区域的序列，成功开发出一个高效表达载体。

2 表达系统的特性对于表达的影响

2.1 表达载体的选择

目前已知的大肠杆菌表达载体至少有以下几种[14]：非融合型表达、融合型表达、分泌型表达。非融合型表达优点在于：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能以及免疫原性等方面基本一致，可以进行后续研究。为了提高翻译效率，人们在设计表达载体时采用了许多办法[15]：①优化翻译起始区以达到高效表达；②构建一套SD-AUG间隔不等的表达载体以供选择利用[16]；③在构建表达载体时，使用近年来发现的“原核翻译增强子”序列，以提高翻译效率[17]；④将“原核翻译增强子”和双顺反子结构结合到一起，从而提高表达效率。此外应用标签技术构建带纯化标记的载体可提高纯化纯度，为生产高纯度高活性的基因工程产品创造了有利条件。

融合表达载体表达蛋白的一般模式为，原核启动子-SD序列-起始密码子-原核结构基因片断-目的基因序列-终止密码子。目前成功的融合表达载体包括：GST（谷光甘肽-S-转移酶）系统、半乳糖苷酶系统、麦芽糖结合蛋白（MBP）系统、蛋白A系统等[18]。由于翻译起始信号在调控翻译强度中是最重要的，融合表达载体通常SD-AUG间隔已固定，翻译起始信号组织合理，有利于翻译起始，且简化了蛋白分离纯化步骤。将分子质量较小的蛋白质以融合蛋白形式表达，可增强mRNA及表达产物稳定性，并生产出可溶性蛋白。

为减少外源蛋白在宿主体内被蛋白酶降解，或者使蛋白质能够在体外正确折叠和便于提纯，常将被表达的蛋白质分泌到细胞外，因此要用分泌型载体，表达分泌蛋白是防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢负荷及恢复表达产物天然构象的最有力措施[19]。然而外源蛋白分泌表达是一个非常复杂的过程，常常会遇到诸如不完全的跨内膜转运[20]、转运装置的容量不足[21-22]。许多因素，包括外源蛋白的大小[23-24]、氨基酸组成[25]及导肽的类型[26]都会对蛋白的转运造成影响。为获得外源蛋白的高效分泌表达，应尽量优化翻译水平，使其与大肠杆菌的转运装置的容量保持一致，共分泌表达分子伴侣或向培养基中加入低分子量的添加剂，往往会提高外源蛋白在细胞周质内分泌表达的水平[27-28]。

2.2 启动子的结构对表达效率的影响

表达载体应含有一个严格调控的强启动子，适用于较大范围的诱导物浓度。严格调控能防止其他蛋白的表达所诱发的菌体内源性蛋白水解酶的释放及细菌的自溶[29-30]。强启动子可以应用于较大浓度范围的诱导物的诱导表达。

大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区，即-10区（位于转录起始位点上游5~10 bp，故称为-10区，序列为5'-TATAAT）和-35区（位于转录起始位点上游25 bp处，一般有10 bp组成，5'-TTGACA故称为-35区）。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17 bp，启动子的活性就越强。所以在构建新的表达载体时要考虑到这一因素的影响。

2.3 宿主菌的选择

表达宿主菌株的选择也是在原核蛋白表达过程中必须要综合考虑的因素。不同的载体适合不同的宿主菌，同种载体在不同的宿主菌中的表达速率并不相同，有时甚至不能表达，并且不同宿主菌之间的生长速度及表达能力也不相同。

另外由于大肠杆菌自身防御系统的保护作用，使得细胞内的重组基因和蛋白可能会被其核酸酶和蛋白酶降解，这种降解作用具有一定的专一性和选择性。因此，选择蛋白酶缺失的宿主菌非常有利于重组蛋白的表达。Invitrogen等公司都已经开发出蛋白酶缺陷型菌株，以减少外源蛋白被降解的可能，从而提高重组蛋白的表达水平。

3 外源基因与系统间的相互作用

3.1 表达基因的调控

在表达过程中，过早的表达产物对于宿主菌有毒害作用，是生长速率下降，甚至导致宿主菌死亡，故应采用诱导型的启动子，以便有效的控制表达的时间。因此，对于这种工程菌一般采用两阶段培养法，即菌体积累阶段和产物表达阶段。

3.2 宿主菌对于质粒拷贝数及稳定性的影响

Engberg[31]发现宿主菌生长速率增大，质粒的拷贝数下降可能因为高生长速率下质粒的复制速度跟不上细胞的分裂速率所致，甚至可能导致质粒的丢失。Jones[32]研究了营养限制连续培养中营养对拷贝数的影响，连续培养 8 d，质粒（PbR322 和 PMBg）没有丢失，但拷数下降了4~5倍，说明营养的限制和缺乏会引起质粒的拷贝数下降。

4 培养条件的控制

培养条件包括培养基成分、温度的选择、诱导条件以及培养时间等等。培养基各组分的浓度和比例要适当，营养丰富的培养基，易于细菌的生长和表达。但过量的营养物质会抑制细菌的生长，特别是碳源和氨源的比例。在大肠杆菌表达系统中，理想的条件是含有适量的 Mg2+、K+、NH4+，高浓度的Ca2+和多胺类，以及充足的ATP和GTP可以显著降低蛋白质合成中的错读。温度的影响也很重要，大肠杆菌的最适生长温度为37℃，温度较低对包涵体表达有利，但不适于菌体的生长；而在最适温度下，菌体生长良好，但因能量过多地用于菌体生长，反而对包涵体的表达不利，最佳诱导温度随产物不同而异。一般来说，在25℃至37℃诱导，外源蛋白易于以活性存在，在37℃ 以上诱导，则易形成包涵体。要选择适当的诱导时间来诱导表达，诱导时间的不同会影响到外源基因的表达以及工程菌的稳定性和活性。提早诱导造成生物质和目的蛋白产量偏低，同时也增加了染菌的机会，而诱导较晚虽可获得高产量的生物质，但细胞表达外源蛋白的时间则减少。细菌在对数生长期，即OD600为0.6附近时，生长状况良好，易于诱导而合成外源蛋白。另外，表达产物的后加工虽不涉及到外源基因的表达，但是采取适当的方法从包含体得到活性蛋白，可以提高产物的回收率。

总之，研究提高外源基因在E.coli中表达效率的工作已进行的十分广泛，被发现的影响表达效率的因素也很多，它们之间有很大的相关性，单单改进其中一个方面往往不能取得明显的效果，有时还存在一定的机遇性。但是，认识到各因素的产生和作用的方式，就能够提出改进表达效率的方法。这方面工作的深入研究有很深远的理论意义和应用价值。

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