吸烟患COPD者与吸烟不患COPD者肺组织中白介素-18表达的研究

高 文 徐永健 刘先胜

(华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科,武汉,430030)

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种严重危害人类健康的疾病,其发病率和死亡率有逐年增加的趋势。据报道,1990年COPD为全球第六位死亡原因,预言到2020年将成为全球第三位致死原因和世界经济负担的第五位[1]。

吸烟是目前公认的COPD的最重要的诱因,但是在吸烟者中,仅有15%-20%的人最终会发展为COPD,这说明在吸烟是否患COPD的发病过程中,存在个体易感性差异 (如遗传因素等)。对于COPD患者,目前尚无有效的阻止病程进展或根治的方法,预防就显得尤为重要。因此,探讨COPD的易感因素和发病机制,对前瞻性地寻找COPD易患个体以及阻断COPD的发生有重要意义。

白介素-18(interleukin-18)是1995年才发现的一种细胞因子,最初因其能诱导 T淋巴细胞产生γ干扰素 (IFN-γ),曾一度被称为γ干扰素诱生因子 (IGIF),后来随着研究的进展,发现它具有多种生物学活性。除了诱导 IFN-γ产生外,还能促进N K细胞的活化与增殖、参与 Th1型免疫反应、增强巨嗤细胞的杀伤活性等,与多种慢性炎症疾病 (如类风湿性关节炎[7]、狼疮性肾炎[17]、克罗恩病[18])有关。提示 IL-18是一个多向性促炎症因子和重要的免疫调节因子。

近年对慢性肺部炎症疾病 (如特发性肺纤维化、COPD)的研究发现其与细胞因子的调节关系密切。有研究报道,COPD患者血清中和诱导痰中的IL-18水平要明显高于无COPD者。但是对人肺组织中IL-18表达的研究很少,并且吸烟是否可以影响肺内IL-18的水平尚不清楚。本实验探讨吸烟患COPD者与不患COPD者肺组织中IL-18表达水平差异,为前瞻性识别吸烟人群中COPD易患个体提供研究资料。

材料和方法

1.材 料

肺组织来源于我院心胸外科2008年11月至2009年2月因肺癌行肺叶切除的30例患者。其中不吸烟不患COPD者10例 (Control组),吸烟不患COPD患者10例 (Smoker组)和吸烟患COPD患者10例 (COPD组)。入选病例均不合并其他慢性肺部疾病,如哮喘、支气管扩张和间质性肺疾病,无心脏病、肝衰竭、肾衰竭等慢性系统性病变。所有病例术前一周内均行肺功能检查。COPD的诊断依据中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制定的《慢性阻塞性肺疾病诊疗指南》[8],入选的COPD患者均处于稳定期。

2.标 本采集

实验所用的肺组织取自尽量远离肺癌病灶(5cm以上),肉眼观察无肺癌浸润的外周肺组织。手术取下肺组织标本,迅速用10%福尔马林充分浸泡固定12h,常规梯度酒精脱水,石蜡包埋。

3.H E染色

取上述人肺组织石蜡块,切片 (5μm),HE染色镜下观察各组肺组织形态学变化。

4.免 疫组化染色

石蜡切片常规脱蜡至水,兔抗人IL-18多克隆抗体 (北京博奥森公司)作为一抗,稀释度为1:200。以PBS代替一抗作阴性对照。采用免疫细胞化学SP法,DAB显色,苏木素复染细胞核,中性树胶封片。

5.结 果判断

细胞浆内有棕黄色细颗粒为阳性染色细胞,观察阳性细胞表达部位。采用 HMIAS-2000高清晰度彩色病理图文分析系统分析图像,在显微镜下以相同外部条件 (亮度)摄取bmp图像。每张片子随机在显微镜下于上、下、左、右、中位置选取5个视野 (100倍放大),测定阳性细胞平均光密度值 (A值),以表示肺组织中IL-18表达的相对量。

6.统 计学方法

实验结果采用SPSS13.0统计软件进行分析。计数数据用χ2检验,计量数据以均数±标准差 (¯x±s)表示,组间差异显著性比较采用 F检验,组间两两比较采用q检验,P<0.05为差异有显著性。对30例患者肺组织IL-18平均光密度值与肺功能指标 FEV1/FVC和 FEV1(%pred)之间的关系采用直线相关性分析。

结 果

1.各 组患者临床资料比较

Control、Smoker、COPD三组之间比较,性别、年龄之间差异无显著性意义 (P>0.05)。Smoker组和COPD组吸烟指数之间差异无显著性意义 (P>0.05)。COPD 组 FEV1(%pred)、FEV1/FVC均降低,与Control组和 Smoker组比较差异均有显著性意义 (P<0.01),而Smoker组和Control组之间比较差异均无显著性意义 (P>0.05)(见表 1)。

表1 3组患者基本情况和肺功能比较 (¯x±s)Table 1 General characteristics and pulmonary function measurements of 3 groups(¯x ±s)

2.肺 组织的形态学改变 (HE染色)

不吸烟不患COPD组 (Control组)与吸烟不患COPD(Smoker组)肺组织切片均无明显炎症变化,表现为肺泡结构完整,大小较一致,肺泡壁薄,无明显充血、出血,肺泡腔内炎性细胞少见。支气管粘膜皱襞完整,管腔内无渗出物,管壁及周围炎性细胞很少见,见图1a、1d、1b、1e。吸烟患COPD组 (COPD组)呈显著炎症变化,可见肺泡中度扩张,肺泡壁有明显断裂,肺泡腔内有大量炎症细胞。外周气道平滑肌明显增厚,管腔内亦有大量炎症细胞浸润,有粘液栓形成。见图1c、1f。

3.肺 组织IL-18的表达 (免疫组化SP法)

3.1 显微镜下观察IL-18的表达

IL-18阳性着色定位于细胞质。染色阳性信号为棕黄色颗粒。三组肺组织IL-18免疫组化染色图像如下 (Control组 2a、2d,Smoker组 3b、2e,COPD组2c、2f)。镜下可观察到 IL-18主要表达于单核-巨嗤细胞、淋巴细胞等的胞浆中,肺泡上皮细胞、细支气管上皮细胞及小血管内皮细胞中也可见到阳性表达。

3.2 IL-18表达的半定量分析

对肺组织IL-18表达的免疫组化图像进行平均光密度 (average optical density ,AOD)测定(具体结果见表2)。COPD组和Smoker组肺组织IL-18的表达量均增加,与Control组比较差异均有显著性意义 (分别 P<0.01,P<0.05);COPD组与Smoker组比较,差异有显著性意义 (P<0.01)。

表2 各组肺组织 IL-18的表达 (AOD值)(¯x±s)Table 2 The comparison of theAOD values of IL-18 in pulmonary tissues of 3 groups

3.3 肺组织中 IL-18的表达与 FEV1/FVC和FEV1(Pred%)的关系

将三组病人综合起来,分析肺组织IL-18平均光密度值与反应气流受限的肺功能指标 FEV1/FVC和FEV1(Pred%)之间的关系,发现肺组织中IL-18的表达量 (用AOD表示)与 FEV1/FVC和FEV1(Pred%)呈显著的负的直线相关关系(分别 n=30,r=-0.778,P<0.01和 n=30,r=-0.520,P<0.01)。随着肺内IL-18表达量的增加,FEV1/FVC和FEV1(Pred%)逐渐降低。

讨 论

长期吸烟是现在已知的COPD的最重要的诱因。吸烟可以引起多种炎症细胞聚集在肺中,通过蛋白水解酶-抗蛋白水解酶体系失衡,氧化应激,以及凋亡机制,导致慢性气道炎症[2]。Kang MJ通过对转基因小鼠的研究发现,吸烟在野生型小鼠可以诱导肺部炎症和肺气肿的发生,但是在 IL-18Rα基因缺乏小鼠,这一作用就大大降低。提示IL-18/IL-18Rα通路在吸烟诱导的肺气肿中可能起关键作用[5]。

成熟的IL-18作为一种炎性细胞因子,已经有实验证明其表达在老鼠致命性的肺部损伤[4]和人类的特发性肺纤维化[6]的发病过程中起了重要作用。近年对慢性肺部炎症疾病的研究发现,IL-18与细胞因子的调节关系密切,在肺慢性炎症的发生发展过程中起着重要的作用。有研究发现,COPD患者诱导痰中的 IL-18水平要明显高于无COPD者[16]。Peterse AM等[9]报道COPD患者血清中和骨骼肌中IL-18mRNA的表达较正常人明显增加,提出IL-18可能参与COPD恶病质的形成的观点。Hoshino T[3]通过对肺内过表达 IL-18的转基因小鼠的研究发现,IL-18在肺内表达增加,可导致严重的肺气肿改变。

在本课题中,我们发现IL-18在肺组织中主要表达在肺泡内和气道内的巨嗤细胞和淋巴细胞中,在肺泡上皮,小血管内皮细胞以及气道上皮细胞等也可见到表达。在无COPD组的肺组织中,IL-18的表达很少,相反的,在COPD患者的肺组织中,炎性细胞大大增加,同时IL-18在各种细胞中的表达也明显增多,提示 IL-18可能通过参与炎症反应,促进COPD的病理发展。对于吸烟是否对肺内IL-18的水平产生影响,我们运用免疫组化染色技术,对IL-18的表达进行半定量测定。组间比较显示,吸烟患COPD组肺组织内IL-18的表达较吸烟不患COPD组和不吸烟对照组明显增加。此结果进一步支持了IL-18在COPD的病理过程中具有重要作用。并且IL-18在吸烟不患COPD者肺中的表达也较不吸烟对照组增高,提示吸烟可能通过增加IL-18的表达来促进 COPD的发生,这也验证了Kang MJ[5]的IL-18/IL-18Rα通路在吸烟诱导的肺气肿中起关键作用的结论。通过对肺组织中IL-18平均光密度值与肺功能指标 (FEV1/FVC和FEV1(%pred))进行相关性分析,我们发现随着肺内IL-18的表达增加,肺部的气流受限也逐渐进展,在是否吸烟、是否患COPD的病人中都呈现此趋势。

对于IL-18参与COPD肺部损伤的机制,可能与其刺激IFN-γ产生、促进中性粒细胞和巨嗤细胞的聚集、诱导 Th1/Tc1配体分化、促进 T细胞和N K细胞成熟、参与复杂的细胞因子网络[10-14],以及调节细胞凋亡[15]有关。但对于 IL-18在COPD患者肺中产生增加,是疾病直接导致,还是由于其它细胞因子作用的继发产生,现在还不得知。

总之,COPD的发病机制非常复杂,IL-18参与其机制形成。同时本课题研究结果提示IL-18可能对前瞻性识别吸烟人群中COPD易感者有一定提示意义。

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图 版 说 明

图1a Control组肺组织,HE染色 ×100

图1b Smoker组肺组织,HE染色。×100

图1c COPD组肺组织,HE染色。×100

图1d Control组肺组织外周气道,HE染色。×100

图1e Smoker组肺组织外周气道,HE染色。×100

图1f COPD组肺组织外周气道,HE染色。×100

图2a IL-18在Control组肺组织中的表达。S-P法,×200

图2b IL-18在Smoker组肺组织中的表达。S-P法,×200

图2c IL-18在COPD组肺组织中的表达。S-P法,×200

图2d IL-18在Control组肺组织外周气道中的表达。S-P法,×200

图2e IL-18在Smoker组肺组织外周气道中的表达。S-P法,×200

图2f IL-18在COPD组肺组织外周气道中的表达。S-P法,×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig 1a Pulmonary tissue of control group.HE staining ×100

Fig1b Pulmonary tissue of smoker group.HE staining ×100

Fig1c Pulmonary tissue of COPD group.HE staining ×100

Fig1d Pulmonary peripheral airways of control group.HE staining×100

Fig1e Pulmonary peripheral airways of smoker group.HE staining×100

Fig1f Pulmonary peripheral airways of COPD group.HE staining×100

Fig2a The expression of IL-18 in pulmonary tissue of control group.SP method×200

Fig2b The expression ofIL-18 in pulmonary tissue of smoker group.SP method×200

Fig2c The expression of IL-18 in pulmonary tissue of COPD group.SP method×200

Fig2d The expression of IL-18 in pulmonary peripheral airway of control group.SP method×200

Fig2e The expression of IL-18 in pulmonary peripheral airway of smoler group.SP method×200

Fig2f The expression of IL-18 in pulmonary peripheral airway of COPD group.SP method×200