金葡菌α-溶血素致大鼠急性肺损伤时肺水通道蛋白AQP1表达的变化

李尔然 王 波 李艳杰 王秋月 康 健

(中国医科大学附属第一医院呼吸疾病研究所,沈阳110001)

肺是气体交换的场所,肺泡和毛细血管间水的平衡对保持肺泡内相对干燥的环境并维持正常的气体交换功能具有重要意义。肺微血管内皮(LMEC)通透性增加造成肺水代谢的失衡是急性肺损伤 (ALI)发病的中心环节。以往人们普遍认为肺水肿主要是由于LMEC受损所致,但随着水通道蛋白AQP1的发现,使人们认识到水通道可能在ALI中起到重要作用。目前已知肺部存在四种水通道蛋白 (AQP1,AQP3,AQP4,AQP5),在生理情况下对肺水的转运起着重要的作用,但近年来发现AQP1尚有除转运水以外的其它重要功能,如促进肿瘤的转移、转运 CO2及O2等,非常引人注目。我们在离体实验中发现,作为ALI的重要致病菌,金黄色葡萄球菌 (S.A)及其主要致病因子α-溶血素 (α-Toxin)可显著影响细胞AQP1的表达[1],本研究拟观察金黄色葡萄球菌α-溶血素致大鼠急性肺损伤时肺AQP1表达的变化,以探讨急性肺损伤时肺水代谢的异常机制。

材料和方法

1.实 验动物分组及处理

随机将24只190-210g健康雄性 Wistar大鼠(购自中国医科大学动物部)分成两组即盐水对照组 (6只)及实验组 (18只)。实验组腹腔注射金葡菌α-Toxin(Sigma公司) (5μg/100g,α-Toxin用生理盐水稀释为3μg/ml),盐水对照组腹腔注射等量的生理盐水。处理后将实验组大鼠按照观察时间随机分成3组 (每组6只),即 6h组,10h组及24h组。盐水对照组观察24h。

2.标 本采集

10%水合氯醛腹腔麻醉 (0.3mg/100g),然后暴露胸腔及腹腔,于腹主动脉抽2ml动脉血,测量动脉血氧分压 (PaO2)。用 4℃,2‰肝素液100ml从右心室灌流鼠肺,同时剪开左心耳及腹主动脉,进行充分血管灌流,直至肺部变白。取右肺下叶于4%多聚甲醛中固定,制成蜡块,作成4μm切片,用于 HE及免疫组化染色。取左肺下叶称湿重 (W)后置于60℃烤箱24h,烤至恒重,称干重(D),计算湿干比重 (W/D)。

3.免 疫组化SABC法染色

按照免疫组化试剂盒SABC法操作。标本经二甲苯及梯度乙醇脱蜡,抗原热修复,加血清阻断剂室温20min,加一抗AQP1抗体 (1:1000)4℃孵育过夜 (抗AQP1一抗和免疫组化试剂盒购自美国Santa Cruze公司),加二抗室温30min孵育,SABC复合物室温30min孵育,DAB染色,苏木素复染,脱水透明,中性树胶封片。每只动物均以Nomal Polyclonal IgG代替一抗设阴性对照。结果通过Metamorph/DP10/BX41显微图像分析系统,测出血管内皮AQP1表达的平均灰度值。

4.统 计学处理

数据以 x¯±S表示,采用SPSS 15.0统计分析软件进行方差分析及q检验。以 P<0.05为有统计学意义。

结 果

1.大 鼠模型的观察

所有实验动物均在观察时间内存活。实验组较盐水对照组体重均有不同程度减轻,且体力明显下降伴有精神萎靡。

2.肺 损伤生物学标志

2.1 肺湿干比 (W/D)及动脉血氧分压(PaO2)测量

实验组与盐水对照组比较,W/D显著增加伴有PaO2显著下降,且10h达损伤高峰,24h指标均有恢复。除6h和24h外,各组间均有显著差异(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠肺湿/干比 (W/D)、动脉血氧分压 (PaO2)(¯x±s)Table 1 Lung wet/dry weight ratio and PaO2in rats(¯x ±s)

2.2 肺组织病理改变

将各组鼠肺行 HE染色,随着观察时间延长,实验组大鼠肺组织损伤程度逐渐加重,6h组主要表现为肺泡间质增宽,轻度水肿。10h则出现较多巨噬细胞并伴有毛细血管扩张及充血。24h开始出现部分肺泡扩张,肺泡壁断裂融合。(见图1)

3.A QP1免疫组化反应染色结果

3.1 AQP1免疫组化反应阳性产物呈棕褐色表达。在正常肺组织中细支气管旁毛细血管内皮、小血管内皮及肺泡周围毛细血管内皮均有AQP1表达,且前两者较后者AQP1表达明显增强 (P<0.05),提示AQP1在肺组织不同部位分布密度不同 (图 2-4)。

3.2 与对照组比较,实验组大鼠细支气管旁毛细血管内皮、小血管内皮及肺泡周围毛细血管内皮部位AQP1表达均有显著下降,以10h组为高峰,24h组AQP1表达有所上调,但AQP1在肺组织各部位免疫定位未发生改变。除6h和24h外,各组间均有显著差异 (P<0.05)。(见表2、图2-5)

表2 大鼠肺不同部位AQP1表达的免疫组化灰度值 (¯x±s)Table 1 Pulmonary AQP1 gray value of immunohistochemistry in rats

讨 论

金葡菌感染已成为血液、皮肤、软组织、下呼吸道感染及ALI的重要因素[2],而且耐甲氧西林金葡菌 (MRSA)所致的感染正在成为临床治疗的难题。金葡菌产生包括α-toxin、γ-toxin、δ-toxin及杀白细胞素等多种外毒素。以往认为单一的毒素不会造成疾病的发生。但最近的研究表明编码αtoxin的基因 Hla是造成金葡菌肺炎的必须因子[3,4],可见α-toxin在疾病的发病机制中占有重要的地位,因为它在细胞膜上可形成亲水性孔道,故又称其为“孔形成毒素 (Pore-forming toxins)”。离体灌注的研究表明[5],肺毛细血管内皮是α-Toxin的重要靶位。非常低剂量的α-Toxin即可致肺微血管通透性增高并形成显著的肺水肿,而AQP1恰好主要分布在肺毛细血管内皮。Verkman等证实敲除AQP1基因的动物肺泡-毛细血管之间的水转移速度明显下降[6]。有研究表明病毒感染及低氧可造成肺水肿并伴有AQP1表达下降[7,8]。Landon等人的研究发现正常人静脉注入大量生理盐水后造成细支气管旁水肿,而先天缺乏AQP1的个体未呈现上述的变化[9]。这些研究说明AQP1在肺水转运以及肺水肿的发病机理中可能起着重要的作用[10]。本研究发现给予大鼠腹腔注射α-Toxin后同样造成了急性肺损伤的病理改变,并且以10h为炎症高峰期 (图1,表1)。

AQP1在肺组织的分布、表达与其功能密切相关。我们分别观察了肺泡周围微血管内皮,小血管内皮及细支气管旁毛细血管内皮三个部位的AQP1表达情况。结果显示AQP1主要分布于肺微血管内皮 (LMEC),包括肺泡周围微血管内皮 、小血管内皮及细支气管旁毛细血管内皮,但分布密度不同,前者明显低于后两者表达,而且AQP1特异表达细胞类型不受α-Toxin的影响 (图2-4)。此外,末梢支气管粘膜下毛细血管床具有大量的AQP1表达,提示AQP1可能参与气道湿化及气道表面液体的产生与调节作用 (图4)。给予α-Toxin后肺损伤程度逐渐加重,同时AQP1在肺LMEC各部位表达明显下降,以10h达最低,24h后AQP1表达有回升趋势,肺水肿也有所减轻。说明AQP1可能促进肺间质水肿液的吸收,对机体起到积极的保护性作用[11,12]。这些数据与腺病毒感染及我们既往的内毒素致ALI的研究结果非常类似[7,13],表明这些致病因子可能存在共同的发病机制。除了可直接造成细胞损伤外,最新研究认为金葡菌α-toxin尚可通过多配体聚糖 (Syndecan)的机制造成肺损伤[14],但这是否有AQP1的参与尚需进一步研究。

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图 版 说 明

图1 金葡菌α-Toxin作用下肺脏的病理变化 (HE染色,×400)

1a正常对照组:肺泡结构完整。

1bα-Toxin 6h组:肺泡间隔增宽,轻度肺水肿。

1cα-Toxin 10h组:肺泡间隔增宽明显,肺泡腔缩小,可见较多巨噬细胞及轻度肺水肿。

1dα-Toxin 24h组:肺泡壁断裂,肺泡扩张融合。

图2 肺泡毛细血管内皮AQP1的表达 (SABC,×400)

2a正常对照组:肺泡毛细血管AQP1表达为深褐色,染色较深。

2bα-T oxin 6h组:肺泡毛细血管内皮AQP1染色减弱。2cα-Toxin 10h组:肺泡毛细血管内皮AQP1染色明显减弱。

2dα-Toxin 24h组:肺泡毛细血管内皮AQP1染色略有恢复。

图3 肺小血管内皮AQP1的表达 (SABC,×400)3a正常对照组:小血管内皮AQP1表达为深褐色,染色较深 (如箭头所示)

3bα-Toxin 6h组:小血管内皮AQP1染色减弱。

3cα-Toxin 10h组:小血管内皮AQP1染色明显减弱。

3dα-T oxin 24h组:小血管内皮AQP1染色略有恢复。

图4 细支气管旁毛细血管内皮AQP1的表达 (SABC,×400)

4a正常组:细支气管旁毛细血管内皮AQP1表达为深褐色,染色较强 (如箭头所示)。

4bα-Toxin 6h组:细支气管旁毛细血管内皮AQP1染色减弱。

4cα-Toxin 10h组:细支气管旁毛细血管内皮AQP1染色明显减弱。

4dα-Toxin 24h组:细支气管旁毛细血管内皮AQP1染色略有恢复。

图5 金葡萄α-Toxin作用下肺不同部位血管内皮AQP1表达的变化

■肺小血管内皮AQP1▲支气管毛细血管内皮AQP1

◆肺泡毛细血管内皮AQP1

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Lung pathologic changes induced byα-Toxin of S.aureus(HE,×400)

1a Control group 1b α-Toxin 6h group

1c α-Toxin 10h group 1d α-Toxin 24h group

Fig.2 AQP1 expression in alveolar capillary endothelia(SABC,×400)

2a Control group 2b α-Toxin 6h group

2c α-Toxin 10h group 2d α-Toxin 24h group

Fig.3 AQP1 expression in pulmonary small vascular endothelia(SABC,×400)

3a Control group 3b α-Toxin 6h group

3c α-Toxin 10h group 3d α-Toxin 24h group

Fig.4 AQP1 expression in parabronchial capillary endothelium(SABC,×400)

4a Control group 4b α-Toxin 6h group

4c α-Toxin 10h group 4d α-Toxin 24h group

Fig.5 AQP1 expression in pulmonary vascular endothelia induced byα-Toxin of S.A

■AQP1 of small vascular endothelia,▲AQP1 of bronchial capillary endothelia,◆AQP1 of alveolar capillary endothelia