RNA 干扰PLCε诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡的实验研究

赵 懿 罗春丽 郭永灿 欧俐苹

(重庆医科大学医学检验系,临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室,重庆市重点实验室,重庆400016)

Ras是最早发现与膀胱癌相关的癌基因[1],而PLCε是一种新的人源性磷脂酰肌醇磷脂酶C(PIPLC)[2],为Ras信号通路的下游分子,能与富含GTP的Ras家族成员以Ras-受体相互作用合而被激活[3]。本研究利用针对 PLCε的shRNA重组质粒转染膀胱癌细胞株BIU-87阻断 PLCε基因表达后[4],观察其对膀胱癌细胞凋亡的影响。

材料和方法

1.材料 人膀胱癌细胞株BIU-87(由重庆医科大学附属第二医院超声研究所惠赠),PLCε shRNA阳性质粒P和阴性质粒NP由本课题组自行构建,Lipofectamine 2000(Invitrogen公司),PCR引物合成 (大连宝生物公司),PVDF膜 (北京鼎国公司),羊抗人 PLCε多克隆抗体 (Santa Cruz公司),流式细胞仪 (美国 FACS-440型),数字化凝胶成像分析仪 (美国Bio-Rad公司)。

2.实验分组 对照组:空白对照组 (只加脂质体)、阴性重组质粒 (转染NP);实验组:阳性重组质粒 (转染 P)。

3.细胞培养及转染 膀胱癌细胞株BIU-87用含10%胎牛血清的RPMI1640培养于37℃、5%CO2的培养箱中,待细胞长满80%-90%时,用脂质体介导重组质粒P和NP进行转染,脂质体与质粒的用量比为 20μl:8μg,转染步骤按 Lipofectamine2000转染说明书操作。

4.RT-PCR检测 PLCεmRNA表达 转染48h后,向各瓶细胞中加入1ml TRIzol待细胞充分裂解后,按总RNA提取操作步骤抽提细胞总RNA,同时提取未转染BIU-87细胞的总RNA作为空白对照。以提取的总 RNA作模板进行 RTPCR反应。引物通过 Primer5.0软件设计,PLCε引物:正义链5’-CATGGAAGGATAA GCGTTGGT-3’,反义链 5’-CCCAA G TCCCGTGTTAAGA-3’,产物长度为395bp;内参 (β-actin)引物:正义链5’-AAGTGCTCC GTGTGGATCGG-3’, 反 义 链 5’-TCAAGTTGGGGGACAAAAAG-3’,产物长度为543bp。反应参数为94℃预变性 2min,94℃30s,56℃30s,72℃30s,35个循环后,72℃继续延伸5min。取PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪分析,用Quantity One图像分析软件测定灰度值,以PLCε/β-actin表达水平行半定量分析,并计算与空白对照的比值 (%)。

5.Western blot检测 PLCε蛋白表达 收集各组BIU-87细胞,按1×107细胞浓度加入100μl细胞裂解液冰上放置30min,4℃12000rpm离心15min,取上清液加上样缓冲液 100℃煮沸变性5min,为确保蛋白上样量一致,样品中蛋白经Bradford定量,通过8%SDS-PAGE分离后转至PVDF膜上。加入羊抗人 PLCε抗体 (1:200)4℃过夜,用 TBST洗膜3次;辣根标记兔抗山羊IgG二抗 (1:5000)37℃温育 2h,TBST洗涤PVDF膜3次后进行化学发光反应。将A、B两种显色底物1:1等体积混和,将混合物覆盖在膜表面,避光反应2min,摇晃使均匀,在BIO-RAD凝胶成像仪上图像分析。

6.FCM检测细胞周期及凋亡 检测细胞周期:将各组BIU-87细胞制成单细胞悬液,用PBS洗涤两次后转入1ml预冷70%乙醇溶液中固定18-24h后与等体积的 PI染液混合,4℃放置 20-30min;测定前将样品用300目的尼龙膜过滤后加入FCM的样品室,以激发波长488nm测定。检测细胞凋亡:收集各组BIU-87细胞1-5×105个,以含10%FCS的1640培养液洗涤2次后用孵育缓冲液5min洗涤1次,用1μg/ml的标记液100μl重悬细胞,室温下避光孵育10-15min;500-1000rpm离心5min沉淀细胞,孵育缓冲液洗1次;加入1μg/ml的AnnexinV和7-AAD荧光溶液各5μl,4℃下孵育20min并避光。激发光波长用488nm,用一波长为570nm的通道滤器检测PE荧光,另一波长大于670nm的滤器检测7-AAD。

7.细胞超微结构观察 收集各组细胞大于1×106个,分别移入四只 EP管中,4℃2000rpm离心20min后弃去上清液,加入4%戊二醛4℃固定2h,0.1MPBS(p H7.2)冲洗,1%锇酸再固定1h后,丙酮梯度脱水,618环氧树脂包埋,半薄切片,光镜定位,超半薄切片做成铅铜网,经醋酸铀、枸橼酸铅染色后,用日本 Hitachi-600透射电镜观察及照相。

8.统计学处理 结果以 ¯x±s表示,采用SPSS10.0统计软件进行处理,采用方差分析、SNK法和t检验,以 P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1.RT-PCR检测转染前后 PLCεmRNA表达结果表明: (见图1、表1)P转染成功后细胞PLCεmRNA表达明显较转染NP和空白对照组减弱,抑制率为78.7%,而β-actin表达量在各组之间无显著差异,证明转染p Genesil-PLCε重组质粒对PLCεmRNA的表达抑制是特异的。

图1 RT-PCR分析各组细胞PLCεmRNA表达1空白对照组;2.阴性质粒组;3.P质粒组;4.DNA marker(100bp)Fig.1 The PLCεmRNA expression in the cells of different group by RT-PCR analysis1.Control group;2.Negative plasmid group;3.P Plasmid group;4.DNA marker(100bp)

图2 .Western blot检测各组细胞PLCε蛋白表达1.空白对照组;2.P质粒组;3.阴性质粒组;Fig.2 The PLCεprotein expression in cells of different group by Western blot

2.Western blot结果 结果见图2。Bio-RAD图像分析结果:P转染组的积分光密度值明显低于其他两组 (表2),P转染组细胞的PLCε蛋白表达受到明显抑制,抑制率是76.6%,差异有显著统计学意义;而NP质粒转染组与空白对照组之间的差异无显著统计学意义。证明转染p Genesil-PLCε重组质粒对PLCε蛋白表达的抑制是特异的。

表1 实验组与对照组PLCεmRNA OD值Table 1 The OD values of PLCεmRNA in experimental and control group

表2 实验组与对照组Western blot条带IOD值变化Table 2 The IOD values of western blot band in experimental and control group

3.流式细胞术检测细胞周期及凋亡 PI单染法检测细胞周期:结果见表3:实验组 G0/G1期细胞比例显著增加,S期和G2/M期细胞比例显著减少,呈明显 G0/G1期阻滞现象且出现了明显的凋亡峰 (sub-G1峰)。证明转染 P质粒能将BIU-87细胞阻滞于 G0/G1期,使进入分裂期 (S期)的细胞数量显著减少,从而促进癌细胞凋亡。

表3 转染重组质粒后BIU-87各组细胞周期分布变化Table 3 The cell cyele changes in Biu-87 cells of different group after plasmid transfection

PE-AnnexinV/7-AAD双染法检测细胞凋亡:结果见图3。BIU-87对照组细胞的凋亡率 (图右下角)为2.77±0.04%,实验组细胞的凋亡率为16.84±2.11%呈显著增高 (P<0.05)。实验表明转染P质粒能诱导BIU-87细胞凋亡。

图3 转染P质粒对细胞凋亡的影响Fig.3 The effect of P plasmid trasfection on cell apoplosis

4.细胞超微结构观察 对照组细胞形状不规则,大小不一,有多个核仁呈核分裂象,核浆比例增大 (图4A);处理组可见细胞染色质凝固、细胞核碎裂,产生凋亡小体 (图4B)。

图4 A对照组 (×7000) 图4B实验组细胞中凋亡小体 (×12000)Fig.4A Control group Fig.4B Experimental group

讨 论

膀胱癌相关基因中,Ras基因最为常见,参与细胞增殖信号传导,编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)[5,6]。Ras激活后,G蛋白只保留 GTP结合活性而无水解活性,故持续激活,有丝分裂信号持续传入,细胞过度增殖[7]。在Ras信号通路众多下游效应蛋白中,近年来磷脂酶C(phospholipase C,PLC)家族中一个新的亚型 PLCε被发现,除与其他PLC同有典型结构域X、Y和C2,其羧基端还具有特异性的 Ras结合 (ras association,RA)结构域和氨基端鸟苷酸交换因子 (guanine nucleotide exchange factor,GEF)结构域[8,9]。各结构域的功能如下:催化结构域X和 Y能够催化 PIP2(磷脂酰肌醇-4,5二磷酸)水解为 IP3(三磷酸肌醇)和DAG(二脂酰甘油);调节结构域C2能接受 G蛋白调节;RA结构域能与富含GTP的 ras家族成员 (如 Ras,Rho,and Gα,β,γ等)以Ras-受体相互作用的方式结合,从而激活PLCε;RasGEF结构域能够作为 Ras的调节因子与Ras结合,促进 ras-GTP的形成,从而激活Ras[10]。此 G蛋白效应酶能被上游的Ras、Rho家族和G蛋白双向调节,参与水解磷脂酰肌醇,还可激活Ras/MAPK途径[11,12]。Bai[13]等认为在化学致癌物诱导皮肤癌过程中PLCε起非常重要的作用,并与肿瘤增殖有关,但PLCε对膀胱癌细胞的作用未见报道。本研究成功构建了针对 PLCε的shRNA抑制其表达,检测PLCε基因沉默对膀胱癌细胞凋亡的影响,为治疗膀胱癌提供新的分子靶点。

细胞周期是指一个细胞经生长、分裂而增殖成两个细胞的全过程,包括两个时期:细胞分裂期(M期)和分裂间期,分裂间期又包括 G0期 (休眠期)、G1期 (DNA合成前期)、S期 (DNA合成期)和 G2期 (DNA合成后期)。有研究认为肿瘤是一类细胞周期性疾病,细胞生长周期的失调在肿瘤的发生发展中起关键作用[14],因而异常细胞周期是解释癌变的中心环节,也是分析转染 PLCε shRNA促进细胞凋亡机制的出发点。我们对转染P质粒的细胞周期的结果分析显示,G0/G1期细胞比例显著增加,S期和 G2/M期细胞比例显著减少,呈明显 G0/G1期阻滞并出现亚二倍体“凋亡峰”(且电镜观察到凋亡小体),使得DNA合成期的BIU-87细胞减少从而抑制了肿瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡。已知多数肿瘤化疗药物均是通过抑制细胞周期达到抗瘤目的,我们的研究显示转染P质粒同样具有细胞周期抑制剂的作用,为其成为肿瘤基因治疗手段的可能性提供了理论依据。

PLCε基因是与肿瘤发生、发展密切相关的一种基因,将其shRNA导入到该基因表达高的膀胱癌细胞系中,可诱导肿瘤细胞凋亡。这一发现为肿瘤的基因治疗提供了新的思路和理论依据。然而对于PLCε基因的研究,还有许多问题需要阐明,如PLCεsiRNA的具体作用途径及其相互关系;肿瘤中PLCε功能失活的基础、表达的调控等,因此PLCε的研究前景广阔。

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