整合素β1在CD151促HUVEC迁移增殖中的机制研究

许富英 罗望翠 曾和松 刘正湘

(华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科 武汉 430030;1孝感市中心医院外科 湖北 432000)

急性心肌梗死是冠状动脉急性狭窄或闭塞,供血持续减少或终止所产生的心肌严重缺血和坏死,是一种严重威胁人类生命和健康的危重症,近年来在我国逐渐增多,血运重建治疗已成为挽救缺血心肌的重要手段。CD151已证实有促进血管形成的作用,但其作用机制尚未完全明了,PI3K/Akt信号通路是细胞内重要的信号转导分子,活化的Akt通过磷酸化作用进一步激活或抑制其下游靶蛋白,进而发挥调节细胞的增殖、分化、迁移及葡萄糖代谢等作用[1-5],本文就整合素、CD151与 PI3K/Akt信号通路之间的联系进行探讨。

材料和方法

1 材料

1.1 细菌与质粒 pZeoSV-CD151由美国Tennessee大学惠赠。pAAV-CD151-HA重组质粒及QRD由本课题组前期构建,rAAV包装质粒pXX2、腺病毒辅助质粒phelper、真核表达载体pXXUF1含绿色荧光蛋白序列 (Green fluorescent protein,GFP)由美国 Pittsburgh大学分子遗传及生物化学系Xiao Xiao博士惠赠。293细胞购自ATCC(美国)。工程菌株 E.coliDH5α由同济医院心血管研究室保存。HUVEC细胞购自武汉大学物种保存中心。

1.2 主要试剂 DNA Maker购自大连宝生物有限公司 (TaKaRa Biotechnology),胰蛋白胨和酵母提取物购自美国DIFCO公司 (DIFCO Laboratories,USA)。琼脂糖agarose购于美 GIBCO公司。细胞培养基DMEM/F12、DMEM、胎牛血清 (FBS)和胰蛋白酶 (Trypsin)等均购自 GIBCO公司。小提试剂盒购自武汉天源公司,蛋白质提取试剂Trizol购自美国Life-technologies公司,抗β-action抗体、鼠抗人CD151单克隆抗体购自美国Serotec公司,整合素β1抗体、PI3K抗体、总Akt抗体、磷酸化Akt抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司,辣根过氧化物酶偶联羊抗兔IgG抗体购自Jackson公司 (Jackson Immunoresearch Lab)。Western杂交显影用增强的化学发光试剂 (Super Signal Substrate,ECL),购自美国PIERCE公司。PVDF膜购自美国Life Science公司。

2 方法

2.1 小量提取质粒 将重组包装质粒以及辅助质粒PXX2和Phelper分别转化大肠杆菌,增菌过夜,按小提试剂盒说明提取质粒,室温离心去上清,依次加入 solutionⅠ/Rnase A混合液,solutionⅡ,Buffer N3,混匀,离心转移上清于新 EP管加0.1倍体积 ETR充分混匀冰上置10min,42℃水槽孵育5min,室温离心转上清于新 EP管加0.5倍体积无水乙醇静置后再将液体转移至新的HiBind Minicolumns柱中离心,弃去收集管中液体,再分别依次加入 HB Buffer和 DNA Wash Buffer离心,弃去收集液,然后将柱子离心甩干,并置一干净EP管中,在无菌操作台加入80-100μl Elution-Buffer静置2min,13000×g离心1min洗脱出DNA,分光光度计定量后-20℃保存备用。

2.2 携带CD151及其突变体基因的重组腺相关病毒的包装及滴度测定 每15μl培养皿加入质粒总量为85μg,将其与双蒸水及2.5mol/LCacl2混匀,然后逐滴加入2×HBS,边加边振摇混合液,室温下静置5min。更换293细胞培养基,将磷酸钙-DNA悬液加入其中,在35℃3%CO2培养24h后更换成无血清高糖DMEM培养基,于37℃5%CO2培养箱继续培养。48h后吸弃所有培养基加入10ml PBS缓冲液冲洗细胞,每盘洗四次,然后加入少量 PBS缓冲液,刮取盘中293细胞,将此细胞悬液在-80℃和37℃反复冻融3次后13000 g×20 min 4℃离心,上清液即为重组腺相关病毒原液。

2.3 斑点杂交法确定病毒滴度 病毒原液用DnaseI和Rnase于37℃孵育1h,蛋白酶 K 37℃孵育1h,酚/氯仿抽提纯化后加入 NAOH/EDTA,沸水煮5min使其变性后立即至于冰上,梯度稀释后的病毒原液经多孔过滤加样器聚集在尼龙膜上,将膜于80℃干烤2h,依次进行预杂交、杂交、洗膜、曝光和洗片后观察结果。

2.4 HUVEC的培养 HUVEC用含胎牛血清 (10%)、肝素钠的DMEM/F12培养基培养,胰酶消化后传代,挑选生长良好的 HUVEC制成细胞悬液,细胞计数后传至六孔板 (随机分为四组:CD151组、QRD组、GFP组、空白对照组)待细胞长至60%融合时每孔更换1ml新鲜培养基,根据病毒滴度于上述四组中按500pfu/个细胞分别加入 rAAV-CD151、rAAV-QRD、rAAV-GFP和等体积PBS,96h后收集细胞,Bradford方法测定裂解液中蛋白的浓度,然后每组取约20μg蛋白质进行western印迹分析,然后用化学发光试剂ECL按试剂说明书要求显影、曝光并用凝胶分析系统灰度扫描来定量检测蛋白质的相对表达量。

2.5 SRB法检测细胞的增殖能力 将上述转染了 rAAV-CD151、rAAV-QRD、rAAV-GFP和等体积PBS的细胞消化后移至96孔板依次分为四组,第一排为空白对照组不加任何液体。接种密度为5×104cell/100μl/孔,每组细胞设置 12个复孔,置37℃5%CO2培养箱中继续培养48h后用三氯醋酸固定,三氯醋酸的终浓度为10%,4℃静置1h后,倒掉固定液,去离子水洗5遍,甩干,空气干燥。SRB用1%的醋酸配成0.4%的溶液,每孔加100μl室温静置10min.未与蛋白结合的SRB用1%醋酸液洗5遍,空气干燥。结合的SRB用150μl 10mmol/l非缓冲 Tris碱液溶解,Biorad酶标仪上测定各孔在490nm的光吸收值。

2.6 划痕试验观察细胞的迁移 分组同上,取各组处于对数生长期的1ⅹ106的细胞接种于六孔板中,置37℃5%CO2的培养箱中孵育,在单层细胞表面用10μl枪头垂直划过并制造多条相互平行的划痕,力度以刮落细胞而不在培养板上留痕为准,PBS清洗3次后加入无血清培养基继续培养,记0、6h、12h、24h,4×倒置显微镜下观察划痕中细胞迁移情况并拍照。实验重复3次。

2.7 统计学分析计量资料结果以平均数±标准差 (¯x±s),采用 SPSS13.0软件对数据进行处理,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P﹤0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1. β1、PI3K、P-Akt及 CD151蛋白表达结果分析 以β-actin为内参,以 Control组表达为100%,CD151蛋白表达量在CD151组为 (268±2.5)%,QRD组为 (253±14.7)%,GFP组为(104±9.2)%,CD151组与 GFP组和 Control组相比CD151的表达明显增加 (P<0.05),QRD组与 GFP组和Control组相比CD151的表达明显增加 (P<0.05),而CD151组与QRD组相比没有统计学差异 (P>0.05),说明转染CD151及其突变体能有效地感染脐静脉内皮细胞,并明显地促进该细胞CD151蛋白表达。蛋白灰度测定结果显示CD151组与 GFP组和Control组比较β1、PI3K及P-Akt蛋白表达量均有显著增加 (P<0.05),而Control组、GFP组和QRD组三组间比较无显著差异 (P>0.05),QRD组与 CD151组相比β1、PI3K及P-Akt蛋白表达量明显减少 (P<0.05),而总Akt各组之间无显著性差异 (P>0.05)。

表1 Western blot分析各组细胞转染病毒后β1、PI3K和 P-Akt表达Table 1 The expression analysis ofβ1、PI3K and P-Akt after transfected virus in each group

2细胞增殖能力结果分析 CD151组 (0.819±0.045)与对照组 (0.530±0.046)和 GFP组(0.575±0.042)相比细胞增殖能力显著增强,有显著性差异 (P<0.05),QRD组 (0.510±0.046)与GFP组和对照组相比无显著性差异 (P>0.05),GFP组与对照组比较无显著性差异 (P>0.05),CD151组与QRD组相比有明显差异 (P<0.05),细胞增殖能力明显增加。说明CD151组有明显促进细胞增殖的能力,而QRD组与CD151组相比增殖能力显著降低。

3.划痕试验观察细胞的迁移能力 24h显微镜下观察结果并通过公式初始宽度-终末宽度/初始宽度计算得知 CD151组细胞迁移率为 (93±2.65)%,而QRD组细胞迁移率为 (57±3.6)%,GFP组和 Control组分别为 (60±2)%和 (54±1)%,CD151组与QRD组、GFP组和Control组相比有显著性差异 (P<0.05),QRD组与 GFP组和Control组相比无统计学差异,说明CD151组促进细胞迁移能力比QRD增强。

图5 Control组、CD151组、QRD组及 GFP组细胞迁移率直方图分析Fig.5 The histogram analysis of cell migration rate of Control,CD151,QRD and GFP group

讨 论

血管形成是在原有血管基础上形成新的血管,对机体许多生理及病理情况都有很重要的作用[6-7]。CD151是一种四跨膜蛋白,它能和多种整合素相结合形成复合体,介导整合素的信号转导,它在细胞迁移、增殖以及体外血管的形成起着很重要的作用。在正常机体CD151缺陷或敲除实验发现其并不影响正常的生理过程,而当机体出现病理情况时CD151在血管形成时起着非常重要的作用,特别是它在病理过程中能够对血管选择性作用,明显改善机体的状况,减少病理情况对机体的损害,成为今后治疗疾病的靶点[8-10]。刺激缺血区小血管生长,促进侧枝循环的形成,完成缺血区血管的自我搭桥现已被誉为分子搭桥术或基因搭桥术[11]。心肌缺血特别是慢性缺血,血管生成及侧枝循环的形成对广泛弥漫性冠状动脉病变患者保护心脏功能,改善患者远期预后起着很关键的作用。王丽等[12]研究已证实在心肌梗死大鼠转染CD151基因后心肌微血管较正常心脏有所增多,而且左室各项功能参数也比对照组明显增加,可明显产生促血管新生效应,进一步改善心肌供血和心脏功能,从而起到保护心脏的作用。但整合素及CD151通过何种机制起到这一作用众说不一,Liu L等[13]研究在基于CD151存在于细胞膜和细胞内囊泡的基础上发现CD151与其相连的整合素α3β1,α6β1及α5β1共同经历细胞的内吞作用并在细胞内小囊泡间隔聚集,并通过改变CD151的构象研究进一步证实CD151促进细胞迁移是通过改变其与整合素共同的囊泡小室而进一步改变其内吞通路所产生的。Baldwin G等[14]研究下调不同类上皮细胞系 (MDA-MB-231和 Hela细胞系)的 CD151的表达可以改变α3β1的糖基化,而改变与CD151相关的其他跨膜蛋白如CD63和CD82却不影响α3β1的糖基化,而且证实在调节α3β1的糖基化及前向迁移能力的过程起着很重要的作用,推测其可能是通过多重并相互独立的机制产生的,其中最重要的可能是通过CD151招募α3β1到跨膜蛋白富集区域,而且这要求CD151能和整合素及其他跨膜蛋白相互作用并相互影响,任何一个环节出现问题都会影响其招募α3β1的聚集,进而影响其糖基化。Zhang XA等[15]研究还发现跨膜蛋白在整合素和PKC的相互作用过程中起着很重要的连接作用,而且可能通过整合素-跨膜蛋白-PKC这个复合体进一步调节细胞的迁移。Armulik A等[16]通过β1缺陷 GD25细胞系研究发现突变体能减少细胞的扩散和迁移并减少动脉硬化的磷酸化及PI3K、A KT的表达,进一步推测这种不显著的PI3K依赖性信号通路是由整合素β1激发的。本研究通过转染CD151及其突变体于脐静脉内皮细胞发现CD151组与QRD组相比β1、PI3K、P-Akt蛋白表达量明显增加,且细胞增殖能力及细胞迁移能力也明显增强,而总Akt和CD151蛋白表达量却没有差别,我们认为转染CD151基因及其突变后都能有效的感染 HUVEC并明显促进CD151蛋白表达,但因为QRD组改变了CD151与整合素β1的正常结合,改变了整合素与下游蛋白的相互作用,明显降低了其生物学效应。通过本研究我们进一步认为CD151促进 HUVEC迁移增殖是通过整合素β1上调PI3K的表达,进一步促进Akt的磷酸化,增加Akt的活力,达到促进内皮细胞的迁移和增殖及管状结构的形成,进而促进血管的形成。

〔1〕Solit D B,Basso A D,Olshen A B,et al.Inhibition of heat shock protein 90 function down-regulates Akt kinase and sensitizes tumors to Taxol.Cancer Res,2003,63(9):2139-2144

〔2〕Yoon K,Jung EJ,Lee SY,et al.TRAF6-mediated regulation of the PI3 kinase(PI3K)-Akt-GSK3beta cascade is required for TNF-induced cell survival.Biochem Biophys Res commun,2008,371 (1):118-121

〔3〕Hirsch E,Ciraolo E,Ghigo A,et al.Taming the PI3K team to hold inflammation and cancer at bay.Pharmacol Ther,2008,118(2):192-205

〔4〕Peviani M,Cheroni C,Troglio F,et al.Lack of changes in the PI3K/AKT survival pathway in the spinal cord motor neurons of a mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis.Mol Cell Neurosci,2007,34(4):592-602

〔5〕Regula KM,Baetz D,Kirshenbaum LA.et al.Nuclear factor-kappaB represses hypoxia-induced mitochondrial defects and cell death of ventricular myocytes Circulation,2004,110(25):3795-3802

〔6〕Dvorak HF.Angiogenesis:update 2005.JThromb Haemost,2005,3(8):1835-1842

〔7〕Carmeliet P.Angiogenesis in life,disease and medicine.Nature,2005,438(7070):932-936

〔8〕Takeda Y,Kazarov AR,Butterfield CE,et al.Deletion of tetraspanin CD151 results in decreased pathologic angiogenesis in vivo and in vitro.Blood ,2007,109(4):1524-1532

〔9〕Karamatic Crew V,Burton N,Kagan A,et al.CD151,the first member of the tetraspanin(TM4)superfamily detected on erythrocytes,is essential for the correct assembly of human basement membranes in kidney and skin.Blood,2004,104(8):2217-2223

〔10〕Wright M.D,Geary S.M,Fitter S,et al.Characterization of mice lacking the tetraspanin superfamily member CD151.Mol Cell Biol,2004,24:5978-5988

〔11〕FolkmanJ. Angiogenic therapyofthe human heart.Circulation,1998,97(7):628-629

〔12〕王丽,杨军,刘正湘,等.CD151对大鼠心肌梗死后血管新生及心功能的影响.中华心血管病杂志,2006,34(2):159-163

〔13〕LiuL,He B,Liu WM,et al.Tetraspanin CD151 promotes cell migration by regulating integrin trafficking.Biol Chen,2007,282(43):31631-31642

〔14〕Baldwin G,Novitsaya V,Sadej R,et al.Tetraspanin CD151 regulates glycosylation of α3β1 integrin.Biol chem,2008,283(51):35445-54

〔15〕ZhangXA,BontraqerAL,HemlerME,etal.Transmembrane-4 superfamily proteins associate with activated protein kinase C(PKC)and link PKC to specific beta(1)integrins.Biol Chem,2001,276(27):25005-25013

〔16〕Armulik A,Velling T,Johansson S,et al.The integrin beta1 subunit transmembrane domain regulates phosphatidylinositol 3-kinase-dependent tyrosine phosphorylation of Crk-associated substrate.Mol Biol Cell,2004,15(6):2558-2567