Balb/C 乳鼠小脑Purkinje细胞原代培养方法

余姗姗 马丽丽 徐善全 陈博 卜碧涛

(华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉430030)

神经元的原代培养是进行神经系统结构和功能研究的重要手段。目前,国内外有关神经元培养的研究较多,但关于小脑 Purkinje细胞培养的报道较少。Purkinje细胞是小脑唯一的传出神经元,许多神经变性疾病如C型Niemann-Pick病 (NPC)与Purkinje细胞的变性、死亡关系密切。因此,在体外条件下建立 Purkinje细胞培养体系,并研究其电生理特性,对明确这些疾病的发病机制十分重要。本研究旨在原有 Purkinje细胞原代培养基础上加以改进,探索一种简便易行的 Purkinje细胞培养方法,并初步研究其细胞电生理特性,为深入研究神经变性疾病的病理机制奠定基础。

材料和方法

1材 料

1.1 动物:出生24h时内的Balb/C乳鼠,雌雄不限。(由华中科技大学附属同济医院动物实验中心提供)

1.2 主要试剂:细胞专用多聚赖氨酸 (Sigma);DMEM/F12(Gibco BRL LifeTechnologies);胎牛血清 (Hyclone);DNaseⅠ (Sigma);谷氨酰胺 (2μmol/l)(Sigma);N2(Sigma);T3(Sigma);免疫染色一抗:Anti-0albindin-D-28K(1:3000) (Sigma);免疫染色二抗:GAM Cy3(1:250) (Sigma);复染剂DAPI(1:1000)(Sigma).

2 方法

2.1 培养皿的预处理:

采用35mm培养皿,每个培养皿放入小圆玻片3-4枚,加入0.1%多聚赖氨酸 (每一玻片滴加一滴为宜)包被2h,用前吸去多聚赖氨酸,用HBSS清洗2次后备用。

2.2 小鼠小脑Purkinje细胞原代培养:

采用 Toshihide Tabata等[1]的方法,略做改进。取生后24h内的Balb/C乳鼠,75%酒精消毒皮肤后,用一手固定乳鼠头部及四肢,一手分层剪开皮肤和颅骨,尽量充分暴露双侧大小脑;用眼科弯镊从大脑顶端将脑组织完整剥离后放入预先置于超净台内的含冰冷 HBSS的称量瓶中;分离小脑并移入另一含冰冷 HBSS的称量瓶,小心去除脑膜和血管;将小脑组织移入含有少量 HBSS的无菌青霉素瓶内,用眼科剪将脑组织剪成1立方毫米大小的小块,加入0.1%胰蛋白酶 (约为组织块体积的10倍)用巴氏管轻柔吹打数次,盖好橡皮塞,于37°恒温培养箱消化11-13min(组织块变疏松,颜色变浅,有时可见粗线状白色漂浮出现);消化完毕,吸去含胰酶的 HBSS液,加入含有12mmol/L MgSO4和5μ/ml DNAseⅠ的 HBSS液终止消化,用吸管轻柔吹打至组织分散均匀后静置5min;用吸管吸取细胞悬液至标准筛过滤;将滤液移入无菌离心管内1200 rpm 4°离心5min;吸弃上清,先加入少量含10%FBS的DMEM/F12培养基,轻轻吹打重新悬浮,取1-2μl细胞悬液于99μl 0.2%-0.4%台盼蓝溶液中,用细胞计数板计算存活和死亡的细胞数,从而测定细胞密度 (细胞计数:活体细胞具有排斥台盼蓝的能力,而死亡细胞则能吸收台盼蓝变成蓝色);以培养基稀释细胞悬液至所需的细胞密度 (5×106cell/ml以上),接种细胞至经多聚赖氨酸包被的培养皿中,置于含5%CO2的CO2培养箱中;培养24h后,用含有1%N2+1%T3+1%谷氨酰胺而不含血清的DMEM/F12培养基换液一次;以后每3d半定量换液一次。

2.3 原代Purkinje细胞免疫荧光染色步骤:

从培养箱内取出培养皿,用弯镊从培养皿中夹取长有细胞的小圆玻片,用4%冷多聚甲醛室温固定15-20min;PBS洗涤2次,每次5min;3%H2O2/0.25%TritonX-100破膜30min;PBS洗涤3次,每次 5min;10%BSA封闭 1h;加入一抗(Calbindin-D-28K抗体)4°C孵育过夜;PBS洗涤3次,每次5min;加入二抗孵育1h;PBS洗涤3次,每次5min;加入三抗DAPI孵育10-15s;PBS洗涤3次,每次5min;50%甘油封片后荧光显微镜照相。

2.4 膜片钳全细胞记录:

与实验当日将微电极玻璃毛坯 (南京泉水教学实验器材厂)经两步拉制成尖端为1-2μm的微电极,充灌细胞内液后入水电阻为2-5MΩ,补偿液接电位;镜下选择表面光滑,胞内无颗粒的健康Purkinje细胞,调节三位操纵器将电极移至细胞上方,稍施负压,形成高阻抗封接 (R>1GΩ)后,c-三ast补偿 (70%-90%);负压破膜后 (R<50MΩ)形成全细胞记录模式,调节c-slow,G-series补偿;脉冲信号经放大器放大后经电极丝和充灌液体的微电极导入细胞,产生的电流信号经放大器转换,软件处理后存于计算机内。

实验过程中,细胞外液中加入河豚毒 (TTX)1μmol/l阻断钠电流,细胞钳制电压为-80mv,给细胞施以10mv,300ms的去极化脉冲刺激,可引出一内向电流。.

2.5 数据分析与统计学处理:

实验记录电流曲线用patch软件进行测量处理,实验数据以 ¯x±s表示,采用 SPSS 15.0 for Window单样本t检验。

结 果

1.小 鼠小脑Purkinje细胞形态学观察

在倒置相差显微镜下,刚接种的神经元呈圆形,透亮,体积较小,单个分散分布;接种6-12h后部分细胞可贴壁,呈圆形,胞体亮,并可观察到少部分细胞开始伸出小的突起;培养24h后可见细胞全部贴壁,且大部分细胞长出突起;第2-3天细胞胞体逐渐增大,突起增多变长;第5-7天神经元胞体明显增大,呈梨形,折光性强,胞浆丰富,核大,核仁隐约可见,从胞体一侧顶端发出2-3条粗的主树突,树突分支繁多,形似扇形,轴突自胞体底端发出,细而直,无分支,细胞突起间相互交织成网状,神经元的生长已比较成熟。

图1 A培养3d的蒲肯野细胞 (×40)B培养7d的蒲肯野细胞 (×40)Fig.1 A Purkinje cell cultured for three days(×40)Fig.1 B Purkinje cell cultured for seven days (×40)

2.神 经元的免疫荧光法鉴定

利用Purkinje细胞特异性Calbindin-D-28K抗体荧光免疫染色,阳性细胞胞浆和突起呈红色,突起纤细,延长;DAPI染胞核着蓝色。阴性对照组无细胞着色。细胞学鉴定阳性率可达70%以上。

图2 培养5d的Purkinje细胞免疫荧光染色 (左:Calbindin-D-28K染色×100;右:albindin-D-28K染色后DAPI复染×40)Fig.2 Purkinje cell cultured for 5 days,immunofluorescence staining(left:Calbindin-D-28K stained ×100; right:Calbindin-D-28Kcounter stained with DAPI Staining)

3.培 养神经元高电压依赖性钙通道电流特征:

膜片钳记录显示,培养的神经元易于封接,成功率在90%以上。在全细胞模式下,钳制电压为-80mV,刺激电压为10mV,时间为300ms,电压钳记录细胞高电压依赖性混合性钙通道,记录的内向电流平均值为68.4±3.34pA(n=80)。该电流可被N型、L型、T型钙通道阻滞剂部分抑制,推测为混合型钙通道。

图3 Purkinje细胞高电压依赖性钙通道电流 (ICa)Fig.3 High-voltage-一ependent Calcium channel currents of Purkinje cell

讨 论

原代神经元在体外发育成熟后,仍保持和接近在体细胞的各项生理参数[8],具有良好的生物可利用性,因此,神经元的原代培养特别适用于形态学和生理学研究。一般说来,神经元的体外培养取材于孕鼠胚胎组织较为理想,因在神经系统早期发育过程中,神经元的增殖始于胚胎期;且胚胎期神经细胞分化程度很低,体外存活能力很强[5]。但取材于胎鼠,胎龄不易确定;需对孕鼠进行剖宫手术,增加污染机会,且对种鼠再生能力有一定影响;胎鼠个体很小,脑组织取材操作复杂,实验难度增加。综合考虑,本实验选用生后24h内Balb/C乳鼠为研究对象,进行体外培养,获得成功并通过膜片钳技术鉴定细胞电生理特性良好。这就明显缩短取材时间,简化操作步骤,从而降低原代培养难度。

由于小脑Purkinje细胞体外生存能力较为脆弱,而且容易退化[3]。因此,在分离培养过程中,更需注意其中的关键操作步骤:1.取脑方法:消毒后直接剪开皮肤和颅骨,暴露脑组织后迅速完整剥离至含冰冷的HBSS的培养皿中,而非断头处死后取脑组织[1],缩短神经元缺氧时间;且整个分离取材及剥离血管脑膜过程均在冰上操作,动作尽量轻巧迅速,最大可能保证神经元的活力。2.酶消化法:选用低浓度 (0.1%)胰蛋白酶,严格控制胰酶用量及消化时间,我们经过较长时间反复摸索发现,一只小鼠小脑组织约使用1ml胰蛋白酶消化12min较为合适,此时细胞数量和状态最佳。3.机械分离:在培养过程中,要数次使用吸管机械分离,有研究表明,反复的吹打过程对细胞的损伤远较酶消化为大。因此,要尽量减少吸管吹打次数,以能分散细胞又不影响细胞活力为最佳,而且用吸管轻柔吹打细胞时,尽量不起泡沫,因为细胞在气液界面不能存活,气泡过多会影响神经元活性。4.接种密度:T oshihide T abata的研究指出,在接种密度为5×106cell/ml的条件下,Purkinje细胞生长旺盛,而且Purkinje细胞长期存活主要依赖于种植密度而非胶质细胞数目。为此,我们在接种前用台盼蓝法测定细胞密度,提高细胞存活率。5.半量换液:细胞接种24h后全量换液,以后每3d半定量换液一次。及时换液有助于维持细胞生长活性,且半量换液既可提供细胞生长所需的营养物质,又可保证神经元相对稳定的生存环境。注意每次换液前,要预热培养基,换液时动作轻柔。

目前,国内外神经元培养常用的培养基分含血清和无血清[1]两类。血清是培养基中主要的营养物质,对神经元的附着、生长、发育、增殖有明显的促进作用[8]。有研究证实,早期使用添加10%胎牛血清的DMEM/F12,Purkinje细胞容易贴壁并且数量增加1.5倍[2]。但在血清长期培养条件下,胶质细胞和成纤维细胞分裂增殖旺盛,可抑制神经元生长,且随着血清浓度的增加,神经元比例减少。综合考虑,我们在神经元培养早期采用添加10%胎牛血清和1%谷氨酰胺的DMEM/F12作为接种培养基,待细胞稳定贴壁后过渡为添加1%N2+1%T3+1%谷氨酰胺的DMEM/F12维持培养。且为了保证神经元的活性以满足膜片钳操作需要,培养过程中不使用阿糖胞苷类有丝分裂抑制剂,减少药物对神经元的毒副作用,使神经元的生长更接近体内自然环境。多次试验证明采用此培养体系可培养出形态典型,生理功能良好的神经元。

研究结果表明,应用本文介绍的培养方法可以获得生长状态较好,活性较好的神经元,且取材容易,操作简便。

〔1〕T oshihide tabata,Satsuki Sawada,Keiko araki,et al.A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons.Journal of Neuroscience Methods,2000,104;45-53.

〔2〕钱洁,祝建,张军,等.不同培养基对小鼠小脑蒲肯野细胞发育的影响.同济大学学报 (医学版),2004,6(25):473-476.

〔3〕T anaka M,Y anaqawa Y,Obata K,et al.Dendritic morphogenesis of cerebellar Purkinje cells through extension and retraction revealed by long-ime tracking of living cells in vitro.Neuroscience,2006,141(2):663-674

〔4〕Furuya S,Makino A,Hirabayashi Y.An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting.Brain res protoc,1998,3(2):192-198

〔5〕王廷华,冯忠堂,Eng-Ang Ling.神经细胞培养理论与技术,第1版,北京:科学出版社,2005,274

〔6〕李妙龄,杨艳,曾晓荣,等.新生大白鼠大脑皮层神经元的培养及其基本电生理血特征研究兰州医学院校报,2003,26(5):377-381

〔7〕Bothwell M.Functional interaction of neurotrophins and neurotrophin receptors.Annu Reu Neurosci,1995,18:223-232

〔8〕Vaccaro DE,Leeman SE,Messer A.Primary cultures of dispersed hypothalamic cellsfromfetal rats:morphology,electrical activity,and peptide content.J Neurobiol,1980,11(4):417-424.

〔9〕于丽华,赵书平,程薇莉.新生大鼠大脑皮层神经细胞培养及影响因素.实用医药杂志,2005,22(10):913-914

〔10〕Banker GA,Cowan WM1.Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.Brain Research,1977,126(3):397-425