上皮性卵巢癌组织中P-A KT、P-gp的表达及其临床病理意义

蔡晓立 王泽华

(随州市中心医院妇产科,湖北 441300 1华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科,武汉 430022)

磷酸化蛋白激酶B (phosphorylated protein kinase B,或称 P-A KT)是PI3K信号转导途径中一个重要的下游靶激酶,处于 PI3K∕ P-A KT信号转导途径的核心部位,具有丝∕苏氨酸激酶活性。P-A KT通过磷酸化 mTOR、P21、GSK3、TSC2等多种作用底物,促进肿瘤细胞生长增殖,抑制细胞凋亡,促进细胞侵袭和转移。最近研究表明,多药耐药基因 (MDR1)是缺氧诱导因子(HIF-1)作用的靶基因,而P-A KT能上调 HIF-1的表达。MDR1所编码的 P-glycoprotein(P-gp)为172KD的跨膜蛋白,可受缺氧诱导,同肿瘤的侵袭性和对化疗抵抗相关[1]。由此可见,P-A KT、P-gp与卵巢癌的发展及预后密切相关。本研究运用免疫组织化学方法检测P-A KT、P-gp在上皮性卵巢癌中的表达,并探讨P-A KT、P-gp在卵巢癌发展过程中的作用、对预后的影响及其之间相互关系。

材料和方法

1.研 究对象

1.1 标本来源:选择我院2002年10月至2003年10月手术切除的上皮性卵巢癌标本60例,国际妇产科联盟 (FIGO)分期Ⅰ-Ⅱ期17例,Ⅲ-Ⅳ期43例。另取同期卵巢良性上皮性肿瘤标本30例和30例正常卵巢组织标本作对照。所有标本均经4%甲醛固定,常规石蜡包埋,连续切片备用。

1.2.主要试剂:兔抗人 P-A KT多克隆抗体,P-gp鼠抗人单克隆抗体,以及即用型免疫组化SP法广谱试剂盒均购自武汉晶美生物工程有限公司。

2.方 法

2.1.免疫组化 SP法测定 P-A KT和 P-gp的表达:对正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤和上皮性卵巢癌中的P-A KT、P-gp蛋白的表达进行检测,试验步骤严格按照试剂盒说明书操作。P-A KT和P-gp的工作液浓度分别为1:50、1:40,以已知阳性反应片作阳性对照,设PBS代替一抗作为阴性对照。

2.2.结果判定:48h内光镜下阅片,高倍镜下随机选取10个视野计数阳性细胞占总细胞数的百分比,取算术平均值。组织切片中显色强度与背景无明显差别为阴性。P-A KT阳性细胞为细胞内呈现均匀的棕黄色颗粒,以胞浆为主,部分胞核表达。P-gp阳性细胞主要着色部位在细胞膜或细胞质,呈现均匀棕黄色。

3.随 诊

全部患者进行定期随访,随访截止日期2007年4月。随访时间42个月至54个月。上皮性卵巢癌 (EOC)复发指经过系统的首次治疗后临床病灶消失,并缓解期至少6个月,再次发现盆腔或腹腔病灶。生存时间为复发后治疗开始至死亡或终检之间的时间。

4.统 计方法

统计学分析采用SPSS13.0 for windows统计软件进行χ2检验和Spearman秩相关分析,P<0.05认为有统计学意义。

结 果

1.P -A KT、P-gp在上皮性卵巢癌组织中的表达

P-A KT蛋白的阳性表达主要位于肿瘤细胞胞浆。P-gp蛋白的阳性表达主要位于细胞胞膜及部分胞浆。在60例上皮性卵巢癌组织中,P-A KT、P-gp蛋白的阳性表达率分别为61.7%、50.0%,均显著高于其在正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织中的阳性表达率,差异有统计学意义 (P<0.05)。见图1,表1。

图1 .A.P-AKT在正常卵巢中的阴性表达;B.P-AKT在卵巢良性肿瘤中的阳性表达;C.P-gp在卵巢良性肿瘤中的阳性表达;D.P-AKT在上皮性卵巢癌中的阳性表达;E.P-gp在上皮性卵巢癌中的阳性表达 (A-E,SP法×400)Fig 1.A.negative expression of P-AKT in normal ovarian;B.positive expression of P-AKT in benign epithelial ovarian tumor;C.positive expression of P-gp in benign epithelial ovarian tumor;D.positive expression of P-AKT in EOC;E.positive expression of P-gp in EOC(A-E,SP method×400)

表1 P-A KT、P-gp在正常卵巢、卵巢良性肿瘤和上皮性卵巢癌组织中的表达Table 1 The expressions of P-A KT、P-gp in tissues of normal ovarian,benign epithelial ovarian tumors as well as epithelial ovarian cancer

表2 P-A KT、P-gp的表达及与上皮性卵巢癌临床病理特征的关系T able 2 The relationship between P-AKT,P-gp protein expression and clinicopathological factors of epithelial ovarian cancer

2.P -A KT、P-gp蛋白阳性表达与上皮性卵巢癌临床病理特征的关系

P-A KT、P-gp蛋白在Ⅲ、Ⅳ期中的阳性率较Ⅰ、Ⅱ期高,阳性组的复发率较阴性组高,差异具有显著性 (P<0.05),见表2。

3.P -A KT和P-gp蛋白在上皮性卵巢癌组织中表达的相关性

在60例上皮性卵巢癌组织中,两者均阳性表达者为26例,均阴性表达者为19例,两者的表达呈显著正相关性 (r=0.26,P<0.05.),见表3。

表3 在上皮性卵巢癌组织中P-A KT与P-gp的表达相关性Table 3 The relationship between the expression of P-A KT and P-gp protein in epithelial ovarian cancer

4.P -A KT和P-gp蛋白的表达与患者生存情况的关系

在60例上皮性卵巢癌患者的随访中,PA KT、P-gp阳性组的生存率 (分别为 62.2%、56.7%)显著低于其各自阴性组的生存率 (分别为91.3%、90.0%),见图2,3。

图2 P-AKT(+)和P-AKT(-)患者的生存率Fig.2 The survival rate of patients with positive and the negative expression of P-AKT

讨 论

1.P -gp与上皮性卵巢癌发生发展的关系

P-pg是分子量为172KD的细胞膜糖蛋白,是ATP结合盒转运蛋白超家族成员之一。P-gp在肿瘤细胞的胞膜上过度表达,利用ATP水解释放的能量将细胞内的化疗药物泵出细胞外,降低细胞内药物的浓度,从而产生耐药性[2]。在导致多药耐药的各种机制中,MDR-1基因编码的P-gp蛋白途径是主要的机制[3]。有资料显示表达MDR/P-gp的卵巢癌随着病情进展,对MDR相关化学药物反应性差[4],与卵巢癌的复发、预后也存在一定关系。

图3 P-gp(+)和P-gp(-)患者的生存率Fig.3 The survival rate of patients in the positive and the negative expression of P-gp

研究显示正常的卵巢组织及卵巢良性肿瘤中几乎检测不到P-gp表达,而卵巢癌组织中P-gp表达阳性率增大 (为50.0%),与 Krasznai等[5]报道的结果相近,这说明P-gp可能是卵巢恶性肿瘤所固有的表达,可能由于癌基因和抑癌基因的改变使MDR1基因活化[6]。Ⅲ、Ⅳ期患者的 P-gp阳性率比Ⅰ、Ⅱ期的明显增高,进一步提示 P-gp表达的上调可能与卵巢癌的发生发展密切相关[7]。P-gp阳性表达可能通过分泌细胞因子、生长因子或其他影响肿瘤组织连接的因子,影响着肿瘤的发生发展。研究显示P-gp阳性组复发率高于阴性组,生存率明显低于阴性组,提示P-gp表达增加可能使细胞内化疗药物的浓度下降从而产生耐药,降低了对癌细胞增长和浸润的抑制,表明P-gp可能是较为有用的判断预后的指标。

2.P -A KT与上皮性卵巢癌发生发展的关系

A KT是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,只有磷酸化的A KT(P-A KT)才具有生物学活性,因其蛋白产物与蛋白激酶A及蛋白激酶C具有高度同源性,又命名为蛋白激酶B(PKB)[8],是一种癌基因。P-A KT通过作用于各种下游分子,调控细胞周期,促进细胞增值,抑制细胞凋亡,从而影响着肿瘤的生物学进展[9]。有实验发现[10]将具有持续活性的myr-P-A KT1基因转导入NH3T3细胞中,导致了细胞的恶性转化,表明P-A KT的异常活化对肿瘤的发生发展起着重要的作用。

本研究发现上皮性卵巢癌组织中P-A KT的表达明显高于正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织,提示P-A KT异常是上皮性卵巢癌的多发事件[11]。随着FIGO分期的进展,P-A KT蛋白阳性表达明显增高,表明A KT激酶活性增高与恶性或更高分期的肿瘤有关,说明P-A KT在卵巢癌的发展过程中起着重要作用。P-A KT阳性组的表达在复发率和生存状况中都与阴性组有很大差异,说明P-A KT的过度活化,能促使卵巢癌细胞黏附运动增强,侵袭力增加[8],可能会使恶性肿瘤易于转移、复发,并导致生存率下降。

3.上皮性卵巢癌中P-AKT与P-gp的相互关系

P-A KT通过磷酸化 mTOR、P21、GSK3、TSC2等多种作用底物,并可能上调缺氧诱导因子(HIF-1)的表达,促进肿瘤细胞生长增殖,抑制细胞凋亡[12],促进细胞侵袭和转移,促进血管生长,抵抗化疗和放疗中细胞的凋亡,提示P-A KT活化可能是肿瘤多药耐药的产生机制之一。最近研究表明,多药耐受基因 (MDR1)可能也是 HIF-1作用的靶基因,它所编码的P-gp糖蛋白可受缺氧诱导,同肿瘤的侵袭性和对化疗抵抗相关,提示P-A KT可能诱导MDR1所编码的P-gp糖蛋白的表达上调。

实验结果显示 P-A KT阳性表达与 P-gp阳性表达呈正相关 (r=0.26,P<0.05),即P-A KT活化的肿瘤组织中存在着P-gp的高水平表达,证明P-A KT不仅通过抑制细胞凋亡来提高肿瘤生存能力,还可以调控多药耐药相关的各种药物转运蛋白直接诱导多药耐药[13]。P-gp的表达可能受活化P-A KT的调节,P-A KT的异常激活可能促进P-gp的过表达,导致细胞内药物浓度降低引起耐药,使药物抑制细胞恶性转化的能力降低,细胞发生癌变能力增强,说明两者有一定的协同作用,可能共同促进卵巢癌的进展并导致远期生存率低。

总之,P-A KT和P-gp在上皮性卵巢癌组织中存在异常的胞浆和/或胞膜表达,异常表达的 PA KT和P-gp与卵巢癌的浸润、转移密切相关,其对预后结果的影响可作为提高治疗效果以及减少肿瘤复发的相关研究的理论基础。

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