复方丹参片质量对其耐缺氧和抗心肌缺血作用的影响Δ

刘明华，杨晓静，刘田云，陈慧慧，孙付军，刘逢芹#(.山东中医药大学药学院，济南市 5055;.山东大学附属千佛山医院，济南市 5004;.山东省中医药研究院，济南市 5004)

近年来复方丹参片配伍的药理研究较多［1］，认为相关药效成分单用时基因表达模式是弱效应的有机整合，而配伍作用模式则是多途径、多效应的综合调节。常跃兴等［2］对我国市场流通的复方丹参片产品质量评价表明不同厂家的产品差异较大，部分药效成分的含量相差数倍甚至几十倍，含量差异可能对药物临床疗效的发挥产生一定影响，为此我们按综合质量评价情况选择3个生产厂家的产品进行药学和药效学实验比较。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

动物为昆明种小鼠，(20±2)g，雌雄各半;Wistar大鼠，雌雄各半，体重200～250 g，均由山东大学实验动物中心供给，合格证号:SCXK(鲁)20090001。

1.2 实验药物

复方丹参片:随机购买于不同的医疗机构，隐去企业名称，编号为1、2、3号;垂体后叶素:上海禾丰药业有限公司产品(批号:080101);冰片对照品(中国药品生物制品检定所，批号743-8902);丹参酮ⅡA对照品(中国药品生物制品检定所，批号110766-200417);丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所，批号111562-200605，含量98.5%)。

1.3 试剂

甲醇、乙腈为色谱纯;实验用水为纯净水;乙酸乙酯、乙醚、苯、硫酸均为分析纯。

1.4 仪器

Waters600高效液相色谱仪，Waters2487紫外检测器，Empower色谱工作站;BP211D型十万分之一分析天平(赛多利斯仪器有限公司);KQ-100DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司生产);XD-7100单道心电图机(上海医疗器械高技术公司生产);202型电热恒温鼓风干燥箱(山东潍坊精鹰医疗器械有限公司生产);0.45 μm微孔滤膜(上海市新亚净化器件厂生产)。

2 方法与结果

2.1 药品质量评价

依照《中华人民共和国药典》(2005年版)标准中复方丹参片项下要求操作，分别对各供试品进行药品质量检测。

2.1.1 崩解时间比较:取各供试品各6片，按照《中华人民共和国药典》附录Ⅻ A崩解时限检查法项下操作，进行崩解时间检查，记录各供试品的崩解时间，求其平均值，结果见表1。

2.1.2 冰片鉴别:取各供试品各5片，研细加入乙醚10 mL，超声处理5 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作为供试品溶液;取冰片对照品适量，加乙酸乙酯制得对照品溶液。取各供试溶液在硅胶 G薄层板上依次点样5 μL，以苯-乙酸乙酯(40∶1)展开，取出，喷以硫酸香草醛溶液，于110℃下烘至斑点显色清晰，各供试样品中冰片成分比较见图1。

采用TLC法对复方丹参片成分冰片的相对含量差异进行了比较，其中1号斑点颜色较深，2号和3号冰片斑点差异不大。

2.1.3 丹参酮ⅡA、丹酚酸B含量测定:按照标准操作，精密称取丹参酮ⅡA对照品，加甲醇溶解配制成每 mL含40 μg的丹参酮ⅡA对照品溶液;精密称取丹酚酸B对照品，加水溶解配制成每mL含80 μg的丹酚酸B对照品溶液。分别取各供试样品10片，研细，各精密称取约1 g，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理 15 min，放冷称重，用甲醇补足重量，微孔滤膜滤过制得丹参酮ⅡA供试品溶液;再取各研细的粉末约0.15 g，精密称定，精密加入水50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷用水补足减失的重量，取上清液微孔滤膜滤过，制得丹酚酸B供试品溶液。

HPLC色谱条件:迪马公司 DiamonsilTM C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇 - 水(85∶15，V/V)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为270 nm，柱温为25℃，进样量为20 μL，测定丹参酮ⅡA含量;以乙腈 -甲醇 -甲酸 -水(10∶31∶1∶58，V/V)为流动相，检测波长 286 nm，其他条件同上，测定丹酚酸 B含量。HPLC图谱见图2、图3，结果见表1。

3个厂家复方丹参片所含药效成分冰片、丹参酮ⅡA、丹酚酸B含量存在较大差异。

图1 复方丹参片冰片TLC图Fig 1 TLC of borneol of Compound Danshen Tablets

2.2 药效学方法与结果

2.2.1 供试溶液的配制:取各供试样品各6片，分别编号为1、2、3组，研细，加水分别配成100 mL 0.9%氯化钠注射液的混悬溶液，作为小鼠灌胃用药物供试液;取各供试品各9片，分别编号为1、2、3组，研为细粉，加水分别配成100 mL 0.9%氯化钠注射液的混悬溶液，作为大鼠灌胃用药物供试溶液;取垂体后叶素注射液，加0.9%氯化钠注射液配成1 U·mL-1的溶液，作为急性心肌缺血动物模型造模用药物。

图2 复方丹参片中丹参酮ⅡA的HPLC图谱Fig 2 HPLC of tanshinoneⅡAin Compound Danshen Tablets

图3 复方丹参片中丹酚酸B的HPLC图谱Fig 3 HPLC of salvianolic acid B of Compound Danshen Tablets

表1 复方丹参片药品质量指标Tab 1 Pharmaceutical quality index of Compound Danshen Tablets

2.2.2 对小鼠常压耐缺氧时间的影响:20～22 g昆明种小鼠，48只，♀♂各半，按体重性别均衡分为复方丹参片1、2、3号给药组和空白对照组，每组12只，雄雌各6只。分组后按照组别分别灌胃给予相应供试品20 mL·kg-1，空白对照组给予同体积水灌胃。1次性给药60 min后，将小鼠按给药顺序逐一放入150 mL广口瓶(内置20 g钠石灰)中，同时密闭广口瓶，记录封闭瓶口至小鼠呼吸停止时间，即常压耐缺氧时间，计算各组缺氧时间的均数，结果见表2。

表2 不同质量复方丹参片对小鼠常压耐缺氧时间的影响(±s，n=12)Tab 2 Effects of different quality of compound Danshen Tables on normobaric hypoxia tolerance time of mice(±s，n=12)

表2 不同质量复方丹参片对小鼠常压耐缺氧时间的影响(±s，n=12)Tab 2 Effects of different quality of compound Danshen Tables on normobaric hypoxia tolerance time of mice(±s，n=12)

注:与空白组变化值比较，*P＜0.05。note:vs.blank group，*P ＜0.05

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记录每只小鼠的缺氧死亡时间，计算各组缺氧时间的均数，结果可见空白组耐缺氧时间较其它各组均稍低，提示复方丹参片给药后能延长小鼠缺氧的存活时间，其中1组延长时间较为明显(P ＜0.05)。

2.2.3 对大鼠急性心肌缺血的影响:200～250 g Wistar大鼠40只，♀♂各半，按性别、体重均衡随机分为1、2、3号组和对照。按照组别分别灌胃给予相应供试品溶液10 mL·kg-1，连续给药3 d，第4 d给药90 min后，参照垂体后叶素致大鼠心肌缺血法［3］操作，将实验动物仰卧位固定，针型电极插入四肢皮下，心电图机的灵敏度调至1 mV=2 mm，速度为50 mm·s-1，记录给药前正常心电图，股静脉快速注射垂体后叶素1.0 U·kg-1体重，于注射后即刻、第 10 s、30 s、1 min、4 min、7 min、10 min各记录心电图1次，观察大鼠心率、S-T段、T波的变化，结果见表3、表4、表5。其影响趋势及变化见图4、图5、图6。

表3 复方丹参片对垂体后叶素致Wistar大鼠急性心肌缺血心率的影响(±s，n=10)Tab 3 Effects of different quality of compound Danshen Tables on heart rates of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=12)

表3 复方丹参片对垂体后叶素致Wistar大鼠急性心肌缺血心率的影响(±s，n=10)Tab 3 Effects of different quality of compound Danshen Tables on heart rates of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=12)

注:与空白组变化值比较，*P＜0.05note:vs.blank group，*P ＜0.05

组别 剂量/片/kg 10 s 30 s 60 s 4 min 7 min 10 min空白 - 485.54±41.01 439.73±114.86 266.57±169.84 196.83±67.99 233.05±72.96 334.31±65.68 308注射前/次/min注射垂体后叶素后即刻332.83±98.16 375.36±123.82.08±89.09 361.34±76.18 1组 0.81 477.12±43.54 456.19±42.36 432.75±97.52 246.52±127.46 251.96±45.09 386.04±58.58 369.48±40.77 398.81±35.29 2组 0.81 501.83±47.03 474.41±67.15 410.02±101.54 209.03±96.47 242.84±115.16 391.99±56.07 397.19±65.25 415.16±60.10 3组 0.81 483.92±49.44 449.75±58.72 369.39±115.69 183.37±95.32 236.87±108.95 360.52±43.61

表4 复方丹参片对垂体后叶素致Wistar大鼠急性心肌缺血S-T段的影响(±s，n=10)Tab 4 Effects of Compound Danshen Tables on S-T segment of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=10)

表4 复方丹参片对垂体后叶素致Wistar大鼠急性心肌缺血S-T段的影响(±s，n=10)Tab 4 Effects of Compound Danshen Tables on S-T segment of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=10)

注:与空白组变化值比较，*P＜0.05note:vs.blank group，*P ＜0.05

组别剂量/片/kg 10 s 30 s 60 s 4 min 7 min 10 min空白 — 0.60±0.305 1.52±1.321 0.24±0.23 0.19±0.36 0注射前/次/min注射垂体后叶素后即刻.29±0.52 0.96±0.75 0.86±0.61 1.11±0.35 1组 0.81 0.65±0.478 1.38±1.319 0.87±0.55 0.39±0.33 0.73±0.29 1.12±0.25 1.16±0.38 1.20±0.32 2组 0.81 0.66±0.23 1.65±1.070 0.89±1.05 0.29±0.54 0.57±0.35 1.02±0.41 1.23±0.26 1.17±0.36 3组 0.81 0.71±0.31 1.60±1.261 1.15±0.72 0.21±0.70 0.34±0.38 1.45±1.11 1.40±0.87 1.07±0.32

心率:空白组大鼠心率即刻即出现心律的降低和心率不齐，与注射前比较心率下降45次/min，出现较为严重的心律不齐(表现为标准差的增加)，注射后即刻至60 s时心率变化较为明显，60 s以后逐渐恢复，至 4 min时心率恢复至 334次/min，7 min时心率与4 min时变化不明显，10 min时心率上升至361次/min，较注射前下降了116次/min。与空白组比较3组实验组对大鼠心率均有不同程度的改变，即刻心率降低程度明显低于空白组，且各组心率标准差明显小于空白组，提示给予复方丹参片可以明显改善心肌缺血对心率和心律的影响，其中1组作用优于2、3组，10 s和30 s时心率的变化趋势同即刻心率一致，60 s～10 min内心率的变化不同程度保持此变化趋势，10 min时1、2组仍明显优于空白组，且标准差较小。

心电图S-T段:空白组大鼠S-T段10 s至30 s时降低，随后呈现抬高趋势，4～10 min时间内抬高的程度无明显变化。观察整个S-T段的变化，空白组大鼠给药后S-T段瞬间抬高即出现病理缺血性降低，于1 min左右即开始恢复性抬高。各给药组对S-T段的影响基本与空白组的变化趋势一致，但S-T段的改变程度较空白组小，其中1号组较其他两组明显。

心电图T波:空白对照组大鼠T波幅度10～60 s时压低，随后逐渐改善，4～10 min时间内T波的变化不明显。各给药组对T波的影响基本与空白组的变化趋势一致，但T波改变程度较空白组小，其中1号组较其他两组明显。

表5 复方丹参片对垂体后叶素致Wistar大鼠急性心肌缺血T波的影响(±s，n=10)Tab 5 Effects of Compound Danshen Tables on T wave of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=10)

表5 复方丹参片对垂体后叶素致Wistar大鼠急性心肌缺血T波的影响(±s，n=10)Tab 5 Effects of Compound Danshen Tables on T wave of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=10)

注:与空白组变化值比较，*P＜0.05。note:vs.blank group，*P ＜0.05

组别剂量/片/kg 10 s 30 s 60 s 4 min 7 min 10 min空白 — 1.78±0.33 2.94±1.59 1.38±0.23 1.05±0.43 1.0注射前/次/min注射垂体后叶素后即刻0±0.76 2.01±1.30 2.06±1.14 1.81±0.34 1组 0.81 1.89±0.53 2.51±1.63 1.91±0.83 1.21±0.68 1.60±0.94 1.91±0.50 2.04±0.52 2.05±0.55 2组 0.81 1.93±0.46 2.82±1.22 1.89±1.25 0.95±0.61 1.32±0.59 1.71±0.79 1.87±0.41 1.96±0.37 3组 0.81 1.88±0.45 2.47±1.68 2.09±1.18 1.12±0.39 1.37±0.30 2.40±0.96 2.17±0.61 2.06±0.57

图4 复方丹参片对心肌缺血大鼠心率的影响Fig 4 Effects of Compound Danshen Tables on heart rates of rats with myocardial ischemia

图5 对急性心肌缺血大鼠心电图S-T的影响趋势Fig 5 Effect tendency of Compound Danshen Tables on S-T segment of Wistar rats with acute myocardial ischemia

图6 对急性心肌缺血大鼠心电图T波的影响趋势Fig 6 Effect tendency of Compound Danshen Tables on T wave of Wistar rats with acute myocardial ischemia

4 讨论

通过对3个供试品的综合质量指标评价，证实不同厂家生产的产品间差异明显，药品中所含比较明确的有效成分含量差异较大，含量大小为1＞2＞3。为了验证药学质量的差别是否会导致其临床疗效不同，我们从药效学角度对其进行了耐缺氧和改善心肌缺血功能方面的对比研究。

垂体后叶素广泛用于急性心肌缺血的造模，是一种简单而稳定的造模方法［4，5］。本实验应用垂体后叶素静脉注射建立大鼠急性心肌缺血模型，观察心电图ST段和T段变化，以比较3个供试品对急性心肌缺血的保护作用。

通过动物实验研究观察，提示3个不同厂家的复方丹参片对上述两实验存在不同程度的影响。3种复方丹参片均不同程度延长小鼠常压耐缺氧时间，其中1号厂家的产品与空白对照组比较有显著性差异(P＜0.05);对垂体后叶素诱导的缺血性心律失常有明显的保护作用，对心肌缺血心电图的ST段及T段改变也具有一定的改善作用。所得数据由于标准差较大，影响均数统计，所以数据通过T检验处理未有理想的统计学意义，但从直观结果上可以明显看出药品质量对疗效的影响，复方丹参片抗心肌缺血作用与所含的化学成分含量呈正相关趋势，产品内在质量与药效发挥有着直接的关联，我国市场上的复方丹参片内在质量有待进一步整顿和提高。

［1］ 张 萌.丹酚酸B/三七总皂苷配伍对心肌梗死大鼠的影响及抑制心肌细胞凋亡的分子机制研究［D］.天津中医学院博士论文，2005，26(3):140.

［2］ 常跃兴，刘田云，刘逢芹.不同厂家复方丹参片丹参酮ⅡA和丹酚酸 B 含量比较［J］.中药材，2009，32(11):1771.

［3］ 叶春玲，吕艳青，杨延秀，等.护心灵对垂体后叶素所致的大鼠急性心肌缺血的保护作用［J］.中成药，2001，3(1):813.

［4］ 陈 奇.中药药理实验方法学［M］.2版.北京:人民卫生出版社，2006:523.

［5］ 徐叔云.药理实验方法学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2003:1009-1017.