DADS对人结肠癌SW480细胞裸鼠致瘤的影响

廖前进 苏 坚 何 洁 宋 颖 唐海林 苏 琦

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的主要成分之一，前期研究发现DADS能抑制胃癌细胞、结肠癌细胞的生长[1,2]，本实验以人结肠癌SW480细胞为研究对象，观察DADS对SW480细胞系裸鼠成瘤的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞和动物

人结肠癌SW480细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中(Gibco公司产品)。在含5%CO2的37℃温箱中培养，每2天传一代。

裸鼠15只，BALB/c/nu/nu品系，雄性，4～6周龄，16～20 g，由中科院上海实验动物中心提供。动物质量合格证号为SCXK(沪)2003-0003。动物饲喂于无特定病原体(specified-pathogens free，SPF)环境中，食物和饮水经灭菌处理后传递投入，自由摄取，光照和气体交换速率等同正常饲养繁育条件。

1.2 药品与试剂

DADS为 Fluka公司产品，分子量为146.28D，纯度80%。DADS与Tween80以1∶2的比例充分溶解后，加入体积分数为0.90的生理盐水稀释100倍，振荡混匀，作为母液保存于-20℃冰箱中，临用时将此母液稀释至所需浓度。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)单克隆抗体、p21WAF1单克隆抗体为Santa Cruz 公司产品，免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。

1.3 裸鼠致瘤实验

实验分组：15只裸鼠随机分为对照组、预防组及体外处理组，每组5只。动物在无特定病原体(SPF)环境中饲养，食物和饮水经灭菌处理后传递投入，自由摄取，光照和气体交换速率等同正常饲养繁育条件。

裸鼠移植：体外处理组(5只)将体外DADS(50 μg/ml)处理48 h后的SW480细胞，0.25%的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，台盼蓝拒染法记数活细胞数占95%以上，将细胞密度调至2×106个/ml，每只裸鼠取0.2 ml细胞悬液接种于右大腿背侧皮下。余10只裸鼠取处于对数生长期的SW480细胞接种，收集细胞、过程及接种方法同前，接种后次日随机分为预防组和对照组(每组5只)，预防组腹腔内注射DADS(15 mg/kg)，对照组腹腔注射相同体积生理盐水，均隔日注射1次，连续给药10次。3组均每4天测肿瘤体积1次，并计算肿瘤体积(V)，V=ab2/2(a为长度，b为宽度)，以每组动物移植瘤体积的平均值，绘制移植瘤生长曲线。实验结束时在超净工作台上完整剥离肿瘤，用电子天平称量移植瘤重量，每组分别取部分移植瘤组织固定于10% 的中性甲醛中，其余均-80℃超低温冰箱保存。计算瘤重抑瘤率。

瘤重抑瘤率(%)=(1-处理组瘤重/对照组瘤重)×100%

1.4 组织形态学观察

取部分移植瘤组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，常规切片作HE染色，光镜下观察组织学形态。

1.5 免疫组织化学

按照免疫组化试剂盒说明书逐步操作，将石蜡切片常规脱蜡、水化后，用PBS冲洗3次，每次5 min；每张切片加一滴过氧化酶阻断剂(试剂A)，室温下孵育10 min；再用PBS洗3次后，滴加非免疫性动物血清(试剂B)，37℃孵育5 min；弃去非免疫性动物血清；滴加一抗，4℃过夜；PBS洗3次后再滴加二抗(试剂C)，37℃孵育10 min；PBS洗3次后滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶溶液(试剂D)，37 ℃孵育10 min；PBS洗3次后，用新鲜配制的 DAB显色液显色，显微镜下观察2～5min；自来水冲洗，苏木精浅染，自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。应用重庆天海医疗设备有限公司生产的病理图像分析系统，进行灰度扫描定量分析。

1.6 流式细胞术

处死裸鼠后剥出移植瘤称重后切取瘤组织15 mg，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×108个/L，用4℃的70%乙醇固定，碘化丙啶DNA染色法，室温下上机分析，应用Coulter公司生产的Epics XL流式细胞仪检测群体细胞中G0/G1、S、G2/M期细胞百分率。

2 结果

2.1 裸鼠生长及成瘤情况

整个实验过程中裸鼠饮水、进食正常且无腹泻、活动迟缓等不良反应，无一荷瘤裸鼠自然死亡。对照组裸鼠均有移植瘤形成，出瘤时间平均为6天，体外处理组2只移植瘤形成，出瘤时间平均为10天，预防组3只有移植瘤形成，出瘤时间平均为8天。裸鼠皮下移植瘤境界清楚，似有包膜，肿瘤表面凸凹不平，成多个结节融合状。对照组肿瘤生长迅速，瘤体积较大，其他2组移植瘤生长缓慢，瘤体积较小。

2.2 DADS对SW480细胞裸鼠致瘤的影响

实验过程中检测瘤体积变化，绘制移植瘤生长曲线。随着时间的延长，移植瘤逐渐增大，与对照组相比，体外处理组和预防组移植瘤生长速度显著减慢(图1)。由表1可见，SW480细胞经DADS体外处理后，其致瘤能力明显降低，体内DADS对人结肠癌的发生有预防作用；体外处理组和预防组与对照组比较，移植瘤体积、瘤重均有显著性差异(P均<0.05)。

图1 DADS对人结肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤生长的影响

表1 DADS对SW480细胞裸鼠移植瘤体积、瘤重的影响

注：*为与对照组比较P<0.05

2.3 DADS对癌细胞形态结构的影响

HE染色光镜下观察肿瘤组织为低分化腺癌。对照组瘤细胞排列紧密且紊乱，异型性大，以圆形或椭圆形为主，核染色深，核仁大而明显，核分裂多；体外处理组、预防组癌巢较清楚，可见腺样结构，癌细胞大小较均匀，胞质透亮状改变，部分癌细胞水变性，核固缩，核分裂相减少，部分癌细胞呈凋亡早期改变。

2.4 DADS对裸鼠移植瘤细胞PCNA、p21WAF1蛋白表达的影响

采用免疫组织化学法，检测裸鼠移植瘤细胞PCNA、p21WAF1蛋白表达情况。3 组移植瘤组织中PCNA蛋白均呈阳性表达，呈淡黄色或棕黄色染色，定位于胞核；p21WAF1蛋白阳性表达主要定位于胞核中，对照组移植瘤组织中p21WAF1蛋白呈阴性表达，而体外处理组和预防组移植瘤组织中其呈阳性表达。经图像灰度扫描分析可见，与对照组相比，体外处理组和预防组PCNA蛋白表达明显减弱(P<0.05)，而p21WAF1蛋白表达明显增强(P<0.05)，见表2。

表2 DADS对移植瘤细胞PCNA、p21WAF1蛋白表达灰度分析

注：*为与对照组比较P<0.05，**为与对照组比较P<0.01

2.5 流式细胞仪检测移植瘤细胞周期分布

流式细胞仪检测结果显示，各处理组与对照组比较，裸鼠移植瘤细胞周期分布发生了明显的改变， 处于G2/M 期细胞显著增多，与对照组比较有显著性差异(P<0.01)，即DADS能改变人结肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤的周期分布，阻滞于G2/M 期，见图2。

图2 DADS处理后裸鼠移植瘤细胞的周期分布 A、B、C分别为对照组、预防组、体外处理组

3 讨论

结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在欧美国家居各种恶性肿瘤发生率和死亡率的第三位，在亚洲居于第四位，严重威胁人民健康与生命，随着人民生活水平的不断提高，有逐渐上升的趋势[3]。流行病学资料显示，在食用大蒜的人群中，结肠癌的发生率及死亡率均低于忌用大蒜的人群[4]。DADS是大蒜中提取的1种低分子量的脂溶性成分，也是大蒜中的主要有效成分，DADS对多种肿瘤均有明显的抑制作用[5～7]。本实验在前期研究基础上研究了DADS对人结肠癌SW480细胞裸鼠成瘤的影响。结果显示，DADS能明显降低SW480细胞裸鼠的致瘤性，且在体内对人结肠癌的发生有预防作用。

细胞增殖核抗原PCNA仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，为真核细胞增殖所必须，是决定细胞存亡的关键蛋白[8]。PCNA表达和合成与细胞周期有关，可以作为反应细胞增殖速度的1个标志，主要表达于增殖细胞的S期、G1期和G2初期，在细胞中表达较高时，细胞DNA可以复制或修复，而表达较低时，细胞则凋亡[9]。p21WAF1属CDKI家族，是第1个被发现的CDK抑制物。p21WAF1具有两个独特的功能区，其N-端部分的残基介导CDK的阻断效应，其C-端可以和PCNA结合，抑制DNA的复制，从而抑制细胞增殖。近年来许多研究表明p21WAF1参与了G2/M期的调控。白叶藤碱通过诱导p21蛋白的表达引起人骨肉瘤细胞G2/M期阻滞[10]；冬虫夏草可通过p21蛋白的介导引起膀胱癌G2/M期[11]。在M期p21WAF1核内聚集，可引起细胞停滞在G1、G2期；S期p21WAF1表达，可导致G2期阻滞[12]。Gotoh等将p21重组腺病毒载体导入到雄激素依赖和非依赖性的前列腺癌细胞系LNCaP、DUl45和PC-3中，发现这些癌细胞裸鼠致瘤率降低[13]。在本研究中同样发现，体内外SW480细胞经DADS处理后，其增殖能力明显减弱，裸鼠致瘤率降低，细胞周期阻滞于G2/M期，且瘤组织中PCNA蛋白表达明显减弱，p21WAF1蛋白表达明显增强。由此提示，DADS可明显降低人结肠癌SW480细胞的致瘤能力，抑制SW480细胞增殖，引起G2/M期阻滞，其机制可能与抑制PCNA蛋白表达，增强p21WAF1蛋白表达有关。

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