可变数目串联重复序列在上海崇明岛地区结核分枝杆菌北京基因型菌株微进化研究中的应用

乔可, 王辉, 杨崇广，罗涛，梅建，高谦

1. 复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032; 2. 上海市疾病预防控制中心结核病防治科，上海 200336

结核病的流行及结核分枝杆菌耐药性的增加，给结核病的预防、控制和治疗带来了严峻的挑战。目前在世界范围内广泛分布、易引起暴发流行且与耐药相关的结核分枝杆菌北京基因型菌株引起了人们极大的关注[1,2]。北京基因型菌株是指具有相似遗传背景和特异间区寡核苷酸分型(spoligtyping)指纹图谱的结核分枝杆菌(缺失1～34间隔区)[2]。根据单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)或长片段多态性(large-sequence polymorphism，LSP)，目前我国流行的北京基因型菌株可分为多个亚型，且不同亚型之间可能存在耐药性和传播力等遗传性状的差异[3,4]。因此，深入研究北京基因型菌株微进化并区分不同亚型，对研究其进化和传播规律都具有重要意义。

基于可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeat，VNTR) 的基因分型方法是一种简单、准确的分子分型手段，由于其分析快速、适用于所有结核分枝杆菌分离株、便于不同实验室结果比较，现已成为分子流行病学研究的常用手段[5]。近期研究表明，VNTR不仅可用于研究北京基因型菌株的近期传播，也是研究其微进化的有力工具[6]。根据基因组NTF区域是否有IS6110插入，可将北京基因型菌株分为ancient和modern亚型[7,8]。在NTF区域有1或2个IS6110插入的modern亚型在全球广泛流行，主要分布于中国、俄罗斯及南非[9-11]。Ancient 亚型以前被称为N家族，在NTF区域不具有任何IS6110的插入，往往与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者免疫力低下相关联[12]，但其只占欧亚大陆北京基因型菌株的小部分。Wada等根据15位点VNTR数据，运用最小生成树(minimum spanning tree, MST)的方法成功将日本的北京基因型菌株划分为由SNP定义的8个亚型，并发现日本的菌株全为ancient亚型[13]。

为建立适合我国北京基因型菌株基于VNTR的进化分析法，我们从上海地区常用的7位点VNTR[14]、日本地区常用的JATA(12)-VNTR[15]及广泛应用的15位点VNTR中选取了22个VNTR位点，对上海地区北京基因型菌株进行分型，同时结合SNP基因分型结果，通过构建MST寻找适合研究北京基因型菌株微进化的VNTR组合及区分不同亚型的分子标志。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

结核分枝杆菌临床分离株来自于上海市疾病预防控制中心保存的上海崇明岛地区痰培养阳性患者就诊时收集的菌株。

1.2 主要仪器及试剂

主要仪器及试剂：基因扩增仪(美国Applied Biosystems公司和Bio-Rad公司)、2×Taq PCR MasterMix(北京天根生物技术有限公司)、凝胶成像仪(Bio-Rad公司)和Quantity One分析软件(Bio-Rad公司)。

1.3 北京基因型菌株鉴定

参照Chen等的方法[16]。

1.4 VNTR基因分型

QUB15、7位点VNTR(VNTR3820、QUB18、QUB11a、QUB11b、MIRU26、Mtub21、 QUB26)及15位点VNTR(QUB11b、MIRU16、MIRU26、Mtub21、Mtub30、ETRA、ETRC、MIRU10、MIRU31、MIRU40、MIRU04、QUB4156、Mtub04、Mtub39、QUB26)的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)引物及条件分别与Kwara、Le Flèche及Smittipat等的实验相同[17-19]，VNTR2074、VNTR2372、QUB3336的PCR引物及条件与Murase等的实验相同[20]。引物由上海Invitrogen公司合成。VNTR分型参照Zhang等的方法[14]。

1.5 SNP基因分型

Filliol等提出利用45个SNP位点对世界范围内的结核分枝杆菌进行分型的方法[21]，我们从中选择只在北京基因型菌株中表现多态性的位点作为区分其不同亚型的标准，共9个位点(909166、797736、2825581、1892017、4137829、2376135、2532616、1692069和1477596)。其中1477596位点的PCR反应体系：引物终浓度0.2 μmol/L，2×Taq PCR MasterMix 5 μl，DNA模板1 μl，ddH2O补至10 μl。PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min；94 ℃变性 30 s，61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，重复20个循环；终末延伸72 ℃ 7 min。其余位点采用连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)分型方法，由上海捷瑞生物工程有限公司协助操作。

1.6 数据分析

使用Microsoft Excel软件分析和处理数据，BioNumerics软件构建MST，VNTR位点的分辨率(Hunter-Gaston discriminatory index，HGI)用下述公式计算：

N指总的样本数，nj是第j个型别的菌株数，s是所有型别的数目[22]。

2 结果

2.1 北京基因型菌株鉴定结果

本研究共获得175株临床分离株，经鉴定(RD-105)筛选出北京基因型菌株135株。患者资料及耐药信息全部由上海市疾病预防控制中心提供，其中男性113例(占83.7%)，女性22例(占16.3%)。年龄18～87岁。

2.2 VNTR与SNP分型结果

为探明不同VNTR位点对北京基因型菌株的分辨能力，本研究利用22个VNTR位点对筛选出的135株北京基因型菌株进行分型，结果见表1。

相对于VNTR，SNP是一种研究进化更精确的工具，VNTR结果必须首先与SNP信息相吻合才具有进化方面的研究价值。为明确适用于研究进化的VNTR组合，本研究首先利用不同VNTR组合构建MST，然后将SNP分出的亚型与MST中的各分支进行比较，观察两者是否吻合。SNP分型结果见表2。135株样本被分为8个序列型(sequence type，ST)，分别为ST26、ST3、ST25、ST19、ST10、ST22、NEW1和NEW2。按照Filliol等的工作[21]，ST26、ST3、ST25和ST19属ancient菌株，ST10和ST22属modern菌株，NEW1和NEW2为新分出的型别。SNP单倍型主要集中在ST10(42.2%)、ST19(30.4%)和ST22(14.1%)3个类型。

2.3 构建MST

合适的MST可区分不同的SNP单倍型，并最大程度区分不同的菌株。为了寻找适合研究北京基因型菌株微进化的VNTR位点组合，我们利用不同VNTR组合构建北京基因型菌株的MST，再通过SNP的分型结果去验证其可靠性。MST分型结果见图1。利用7位点VNTR绘制的MST(图1A)，SNP单倍型分布散乱，没有规律，不能区分ancient与modern亚型；而利用15位点VNTR所构建的MST(图1B)，与SNP分型信息基本吻合，但ancient亚型ST相对散乱。分析发现，7位点VNTR的总分辨率为0.9997，15位点VNTR的总分辨率为0.9879，虽然前者的分辨率高于后者，但后者更适合于研究种系的发生。由此可见，研究种系发生时需将高分辨率的位点与低分辨率的位点相结合。

表122个VNTR位点在135株结核分枝杆菌北京基因型菌株中的分辨率

Tab.1HGIof22VNTRlociin135M.tuberculosisstrainsofBeijinggenotype

VNTR aliasNumber of allelesAllelic diversity (HGI)VNTR3820230.925QUB18120.851QUB11a150.767QUB11b70.662QUB26110.633Mtub2170.582QUB415640.550MIRU26110.539QUB1530.490Mtub0440.333QUB333660.259VNTR237250.246MIRU4050.244VNTR207430.205Mtub3950.180ETRA30.178MIRU3170.168MIRU1630.153MIRU1030.152ETRC50.142Mtub3030.086MIRU0430.072

15位点VNTR所构建的MST中，ancient亚型ST相对散乱，这可能是由于某一高分辨率位点的存在引起的。在15位点的基础上，将HGI>0.5的位点逐一去掉，添加一些低分辨率的位点。结果显示，去掉MIRU26(HGI>0.5)，添加2个分辨率相对较低的位点VNTR2074、QUB15(HGI<0.5)，基于这样的16位点所构建的MST(图1C)能较好区分不同的SNP单倍型，并最大程度区分不同的菌株，适用于北京基因型菌株微进化的研究。

表2135株结核分枝杆菌北京基因型菌株的SNP分型结果

Tab.2TheSNPgenotypingresultsof135M.tuberculosisstrainsofBeijinggenotype

Type of sequenceAlleles in indicated SNP position of H37Rv7977362825581189201741378299091661477596237613525326161692069Number of isolates (%)SubfamilyST10TGCTTTAGA57 (42.2)ModernST22TGCTTTGAA19 (14.1)ModernST19TGCTTCAGA41 (30.4)AncientST25TGCTCCAGA1 (0.7)AncientST26CTTCTCAGA10 (7.4)AncientST3TGTCCCAGA1 (0.7)AncientNEW1TGTCTCAGA4 (3.0)AncientNEW2TGTTTCAGA2 (1.5)Modern

MSTs of 135M.tuberculosisstrains of Beijing genotype based on 7-locus-VNTR (A), 15-locus-VNTR (B) and 16-locus-VNTR (C). Each circle means a different type identified by VNTR genotyping, and the size of the circle means quantity of isolate. Heavy lines connecting two VNTR types denote single-locus variant, thin lines imply double-locus variant, and dotted lines (black) imply triple-locus variant. Grayed dotted lines mean variants in more than three loci. Among these isolates, ST10 includes 57 isolates, ST19 includes 41 isolates, ST22 includes 19 isolates, ST26 includes 10 isolates, ST3 includes 1 isolate, ST25 includes 1 isolate, NEW1 includes 4 isolates, and NEW2 includes 2 isolates.

图1135株结核分枝杆菌北京基因型菌株的MST

Fig.1MSTsof135M.tuberculosisstrainsofBeijinggenotype

2.4 区分不同亚型/ST的分子标志

在构建MST的过程中，我们找到一些与北京基因型菌株亚型区分密切相关的VNTR位点(表3)。这些位点与所对应的亚型/ST有很高的相关性，提示很可能是区分北京基因型菌株不同亚型/ST的分子标志。

表3VNTR位点与各亚型/ST的相关性

Tab.3ThecorrelationofVNTRandsublineage(s)/STs

VNTR locusSpecific alleleCorresponding sublineage(s)/STsSpecificity (%)Mtub213Ancient924Modern96QUB268Modern78MIRU164NEW1100QUB41563Modern974ST261005ST19,NEW198

3 讨论

相对于以类群为进化单位的宏进化，微进化是以生物个体作为进化的基本单位，是生物多样性的来源。VNTR基因分型技术操作简单，能提供数字式的分型信息，具有很高的可重复性，已成为非常具有吸引力的结核分枝杆菌指纹图谱分析的方法[17,23]。近期研究表明，在结核分枝杆菌这个保守性很高的克隆群体中，基于VNTR构建的种系发生树(MST)与基于SNP单倍型定义的亚型之间有高度的一致性。与SNP相比，由于VNTR的高变性，基于VNTR的种系发生树能反映同一亚型中菌株的微进化特征[24]。

北京基因型菌株在东亚地区广泛流行，并且在世界其他地区暴发的概率明显高于其他类型菌株，很多研究都致力于探明其在感染与流行方面的规律[21,25]。本研究利用22个VNTR位点对135株上海崇明岛地区的北京基因型菌株进行分型并构建MST，发现16位点VNTR较适合于研究北京基因型菌株的微进化。本研究还发现，利用MST方法研究微进化，必须选择一些分辨率高的位点(如QUB11b、QUB26和Mtub21)，同时也要选择一些进化上相对保守的位点(如ETRC、Mtub30和MIRU04)。选择7位点VNTR进行菌株基因型分析主要是基于分辨率的高低，而选择16位点VNTR则是在分辨率与保守性上的折中。

4个VNTR位点(Mtub21、QUB26、MIRU16和QUB4156)与相应北京基因型菌株不同亚型的相关性非常高，提示这些位点可能是区分不同亚型的分子标志。目前在全球范围内流行的北京基因型菌株大多为modern 菌株[7,11]。近期，日本的Wada等利用15位点VNTR构建MST，表明在日本流行的主要为ancient菌株，来自中国与蒙古的北京基因型菌株都属于modern菌株[13]。本研究结果显示，在上海崇明岛地区不仅存在modern菌株，还存在ancient菌株。但本研究所选菌株均来自上海崇明岛地区，由于地域上的局限，流行菌株具有较强的地域性，所得结论是否普遍适用于结核分枝杆菌北京基因型菌株，还需要进一步研究。

总之，本研究结果提示，利用16位点VNTR来研究上海崇明岛地区北京基因型菌株的微进化比较合适，能为北京基因型菌株分子流行病学框架的构建、菌株进化研究和临床菌株的基因型分析提供帮助。同时4个VNTR位点(Mtub21、QUB26、MIRU16和QUB4156)可能是区分北京基因型菌株不同亚型的分子标志，这将为研究北京基因型菌株不同亚型的传播、致病性及毒力因子提供便利。

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