南京地区1 386株临床分离酵母的鉴定及药敏分析

李汇明，梅亚宁

1. 南京医科大学诊断学教研室，南京 210029；2. 南京医科大学第一附属医院检验科，南京 210029

随着免疫抑制剂、广谱抗菌药物、动静脉置管和其他插管的广泛使用及组织器官移植、化疗手段在临床的应用，深部真菌感染病例不断上升[1-3]，特别是假丝酵母(又称念珠菌)感染已成为日益突出的问题。为研究深部感染酵母的病原学特征及其对药物的敏感性，本文对我院2008年1～12月临床分离的1 386株酵母进行鉴定及药敏分析，以便为临床更有效、合理地使用抗真菌药物提供依据。

1 材料和方法

1.1 菌株

2008年1～12月从我院深部真菌感染的临床标本中分离到1 386株酵母，其中来源于下呼吸道痰标本744株(53.68%)，尿液标本211株(15.22%)，鼻咽拭子标本137株(9.88%)，其他分泌物脓标本95株(6.86%)，血液标本78株(5.63%)，其他标本121株(8.73%)。标准菌株、白假丝酵母ATCC 64548和白假丝酵母ATCC 64550由广州迪景微生物科技有限公司提供。

1.2 试剂

沙保罗培养基购自英国Oxod公司，CHROMagar Candida显色培养基购自郑州博赛公司，Rosco Neo-Sensitabs抗真菌药敏纸片(包括两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和克霉唑)购自广州迪景微生物科技有限公司。

1.3 菌株分离鉴定

菌株在CHROMagar Candida显色培养基30 ℃培养48 h，根据菌落颜色可鉴定出白假丝酵母、热带假丝酵母、光滑假丝酵母和克柔假丝酵母。不能用显色培养基鉴定的菌株，用沙保罗培养基35 ℃培养48 h，分离、纯化，用API 20C AUX鉴定到种，仍不能鉴定到种的为其他假丝酵母。

1.4 药敏试验

采用琼脂扩散法RPMI 1640培养基，即3-吗啉丙磺酸加2%葡萄糖，再加入1.8%琼脂，于无菌水中加热溶解。调pH至7.0，15磅15 min高压灭菌。45 ℃加入RPMI 1640培养液，混匀后倾注平板，厚度(4.0±0.5)mm，冷却备用。用0.85%生理盐水调菌液浓度为1×108cfu/ml，用无菌棉拭沾菌液，3个方向均匀涂于RPMI 1640培养基表面。将含药片纸贴于平板表面(片距>25 mm)，35 ℃培养18～24 h，测量抑菌环，判读结果。

1.5 药物敏感性判定标准

根据Rosco Neo-Sensitabs抗真菌药敏纸片的基本抑菌圈判读标准，两性霉素B、伊曲康唑、制霉菌素抑菌环直径≥15 mm为敏感，10～14 mm为中介，<10 mm为耐药；氟康唑、克霉唑、5-氟胞嘧啶抑菌环直径≥20 mm为敏感，12～19 mm为中介，≤11 mm为耐药；伏立康唑抑菌环直径≥14 mm为敏感。

1.6 数据分析

数据采用Whonet 5.4软件进行分析。

2 结果

2.1 真菌培养结果

2008年1～12月从疑为深部真菌感染的我院门诊及住院患者4 845例标本中共检出1 386株酵母，其中白假丝酵母817株(58.95%)，热带假丝酵母221株(15.95%)，光滑假丝酵母210株(15.15%)，克柔假丝酵母38株(2.74%)，近光滑假丝酵母35株(2.53%)，葡萄牙假丝酵母22株(1.59%)，季也蒙假丝酵母5株(0.36%)，无名假丝酵母4株(0.29%)，都柏林假丝酵母2株(0.14%)，酿酒酵母2株(0.14%)，新生隐球菌2株(0.14%)，毛孢子菌2株(0.14%)，其他酵母26株(1.88%)(表1)。患者年龄21～92岁，其中>60岁896例(64.65%)。检出率最高的为痰标本，其次为鼻咽拭子、尿液。1 386株酵母在各标本中的分布见表2。

2.2 真菌药敏试验结果

1 386株酵母中，白假丝酵母、热带假丝酵母、光滑假丝酵母和克柔假丝酵母4种常见真菌对氟康唑的敏感率分别82.99%、79.19%、68.57%和28.95%；白假丝酵母对7种抗真菌药物的敏感率依次为5-氟胞嘧啶(93.76%)、两性霉素B(93.15%)、制霉菌素(84.58%)、伏立康唑(84.09%)、氟康唑(82.99%)、伊曲康唑(80.05%)和克霉唑 (78.09%)。结果见表3。

表11386株酵母的分类

Tab.1Speciesdistributionof1386strainsofyeast

StrainnPercentage (%)Candida albicans81758.95Candida tropicalis22115.95Candida glabrata21015.15Candida kruse382.74Candida parapsilosis352.53Candida lusitaniae221.59Candida guilliermondii50.36Candida famata40.29Candida dubliniensis20.14Saccharomyces cerevisiae20.14Cryptococcus neoformans20.14Trichosporon asahii20.14Others261.88Total1386100

表21386株酵母在不同标本中的检出率及构成比

Tab.2Isolationrateandconstituentratioof1386strainsofyeast

SpecimennPositiveIsolation rate (%)Constituent ratio (%)Sputum138074453.9153.68Urine99221121.2715.22Blood7267810.745.63Swab48613728.199.88Secretion5289517.996.86Others73312116.518.73Total4 845138628.61100

表31386株酵母对7种抗真菌药物的敏感率(%)

Tab.3Sensitiveratesof1386strainsofyeasttosevenantifungaldrugs(%)

StrainnFluconazoleItraconazoleVoriconazoleAmphotericin B5- FlucytosineNystatinClotrimazoleCandida albicans81782.9980.0584.0993.1593.7684.5878.09Candida tropicalis22179.1981.9082.8190.0590.9580.5475.11Candida glabrata21068.5771.4373.8189.0572.3874.7671.43Candida kruse3828.9584.2144.7484.2126.3218.4218.42Candida parapsilosis3594.2997.1497.14100.00100.0094.2994.29Candida lusitaniae2295.4595.45100.00100.00100.0090.9190.91Candida guilliermondii580.00100.00100.00100.00100.00100.0080.00Candida famata450.0075.0075.00100.00100.00100.0075.00Candida dubliniensis2100.00100.00100.00100.00100.0050.0050.00Saccharomyces cerevisiae2100.00100.00100.00100.00100.0050.0050.00Cryptococcus neoformans2100.00100.00100.00100.00100.0050.0050.00Trichosporon asahii2100.00100.00100.00100.00100.0050.0050.00Others2665.3880.7784.62100.00100.0065.3861.54

3 讨论

近年来，真菌感染已成为医院感染的重要部分，尤其是由假丝酵母(白假丝酵母、热带假丝酵母、光滑假丝酵母)引起的侵袭性真菌感染呈上升趋势。假丝酵母已是医院感染的主要病原菌，成为仅次于大肠埃希菌、铜绿假单胞菌，居医院感染第3位的病原菌。本研究显示，在分离的1 386株酵母中仍以白假丝酵母比例最高，其次是热带假丝酵母和光滑假丝酵母，与国内、外的监测基本一致[4,5]。本研究结果还显示，除常见的白假丝酵母和热带假丝酵母外，还检测出阿萨希毛孢子菌、酿酒酵母、葡萄牙假丝酵母等过去少见的酵母。菌种分布呈多元化，这可能是由于近年来酵母分离、培养、鉴定的方法有所改进，检验人员对菌种鉴定给予足够的重视；也可能是由于近年来抗真菌药物的广泛使用，使菌群分布发生了改变。因此，重点监测以白假丝酵母为代表的假丝酵母属感染是临床预防和治疗真菌感染的关键。此外，对临床上其他酵母所致感染也要引起足够重视。

1 386株酵母主要来源于痰标本(53.91%)，与国内报道相似[6]；其次是尿液。值得重视的是血液中假丝酵母的检出率达10.74%，构成比为5.63%。这可能与近年来器官移植、介入诊治方法的广泛开展，以及化疗、广谱抗菌药物的应用有关。

1 386株酵母对7种抗真菌药物的体外敏感试验结果表明，目前临床常用的抗真菌药物对常见的酵母均有较强的活性。使用两性霉素B产生的不良反应大，临床用量较少。而氟康唑不良反应小，较安全，能广泛渗透至体液、组织和器官，对白假丝酵母、隐球菌感染疗效较好，目前临床广泛使用；但由于其大量使用，部分酵母已出现耐药。部分酵母同时对数种咪唑类药物耐药，提示咪唑类药物之间存在交叉耐药现象。当前临床经验性抗真菌药物治疗常首选氟康唑，4种常见假丝酵母中白假丝酵母对氟康唑最敏感，这可能使非白假丝酵母逐渐成为优势菌群。因此，有必要动态监测真菌菌群的构成变化。临床微生物实验室要加强真菌分离、培养和鉴定，建立抗真菌药敏试验方法，加强对酵母样真菌耐药性的监测，为临床抗真菌感染治疗提供有效的实验室依据。

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