CD147、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在不同级别的脑胶质瘤中的表达及其意义*

居红格 蒋剑英 沈淑萍 耿 虹

(包头医学院病理学教研室，内蒙古 包头 014060)

神经胶质瘤亦称胶质细胞瘤，简称胶质瘤(Gliomas)，是发生于神经外胚层的肿瘤，颅内最常见的恶性肿瘤，其具有发病率高、复发率高、死亡率高和治愈率低的特点，主要原因是由于胶质瘤的侵袭性生长，使其不能完全治愈。肿瘤的侵袭生长是一个多因素参与的复杂过程，而现在认为在脑胶质瘤侵袭性生长过程中起关键作用的是一类基质金属蛋白酶(matrix-metallo-proteinase, MMPs)， MMPs是一组由结缔组织细胞分泌的，依赖 Zn2+的蛋白酶家族，几乎能降解细胞外基质和基底膜(ECM)，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。而MMPs的表达水平及其活性受多因子调节，尤其与细胞外基质金属酶诱导蛋白CD147和组织抑制物TIMPs的关系密切。本研究旨在探讨 CD147、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在不同级别的脑胶质瘤中的表达及其内在的相互作用，进一步阐明胶质瘤侵袭性生长的机制，从分子生物学水平，为临床治疗提供进一步理论基础。

1 材料与方法

1.1一般资料 收集包头医学院第一、三附属医院、包头市二医院病理科存档的2002—2010年的石蜡组织标本78 例，经病理学证实为胶质瘤。所有病例临床资料齐全，其中男48 例，女30例。平均年龄42.4( 7-78 ) 岁。按照2007年WH0神经系统肿瘤分类标准，将胶质瘤按生物学行为分为4 级: I级21例，II级22例，III级20例，IV级15例。将I 、II 级归为低级别组，III、I V级归为高级别组。对照组12例取自非肿瘤患者。

1.2试剂与方法 采用免疫组化SP法。TIMP-2、TIMP-1 兔抗人CD147单克隆抗体浓缩型购自长岛生物技术有限公司，鼠抗人MMP-1，MMP-2，MMP-9一抗和D A B显色试剂盒均购自福州迈新公司。肿瘤标本常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后将标本置于PH6.0枸橼酸缓冲液中进行抗原修复,PBS缓冲液冲洗3次，每次5min，加过氧化酶阻断剂，室温孵育20 min，PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min，加血请室温孵育20 min，甩干血清,滴加一抗,4 ℃冰箱孵育过夜， PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min，滴加生物素标记二抗，孵育10 min，PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min，最后滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液,室温孵育10 min,PBS缓冲液冲洗3次5 min，DAB反应显色后自来水充分冲洗、苏木素复染。常规脱水、透明、干燥封片后镜下观察。分别用已知一抗表达阳性的乳癌和鳞癌切片作阳性对照,PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3结果判定标准 所有结果均经过病理科两位病理诊断医师采用盲法进行确认。根据染色程度进行评分: 基本不着色给0 分，淡黄色给1分，棕黄色给2分， 深棕色给3分。每张切片随机选取5个高倍视野(x4OO)， 计算出每个视野阳性染色肿瘤细胞的百分数，并取其平均值进行评分：阳性染色肿瘤细胞的百分数<1记为0 分，10% ～24% 记为1分，25%-49%记为2分，50%～74%记为3分，75% ～100%记为4分。最后将阳性率评分与强度评分相乘所得之积进行分级，0 分为(-)，1-4分为(+)， 5-8分为(+ +)， 9-12分为(+++),为该组织的免疫组化最终评分。

1.5统计学处理 应用SPSS13.0统计软件分析数据。组间比较采用χ2检验,相关性检验采用Spearman相关分析,以P<0.05为差异具有统计学意义 。

2 结 果

2.1表达结果：CD147、MMP-1、MMP-2、MMP-9表达主要定位于细胞浆(见图1)，在正常的脑组织中几乎不表达，在胶质瘤中的表达阳性率分别为62%，66%，64%，75%，随着肿瘤的恶性程度升高，其表达水平和强度增加(见表1)。TIMP-1、TIMP-2表达主要定位于肿瘤细胞胞浆和血管内皮细胞胞浆(见图1)，在12例正常脑组织中1例TIMP-1表达(+)，2例TIMP-2表达(++)，在胶质瘤中明显表达，TIMP-1和TIMP-2的阳性表达率均为59%,并随着肿瘤的恶性程度升高，它们的表达水平和强度也增加(见表1)。把肿瘤标本分为低级别组和高级别组，分别对这6个蛋白的表达进行χ2检验均具有统计学意义(见表2)。

表1 CD147 、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在胶质瘤的病理分级中的阳性表达率

备注：括号内为阳性表达例数。

表2 CD147 、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在胶质瘤的临床分级中的阳性表达率

2.2表达相关性 对本实验免疫组化结果进行Spearmen相关分析： CD147、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1的表达分别与胶质瘤的恶性程度呈正相关(rs=0.2671～0.5631，P<0.01)。但随着恶性肿瘤程度增加，TIMP2/MMP-2, TIMP-1/MMP-9的比值降低(见表3)。CD147与MMP-1、MMP-2、MMP-9之间具有明显的正相关关系(rs=0.3481～0.4951，P<0.01)。

表3 不同级别胶质瘤中的TIMP2/MMP-2和TIMP-1/MMP-9的比值

图1 CD147、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表达结果

3 讨 论

胶质瘤侵袭性生长涉及多个过程，其中细胞外基质的降解是肿瘤细胞侵袭的前提，MMPs与细胞外基质降解密切相关，其属于一大家族酶类系统，分为4类，即：1.间质胶原酶；2.胶原酶；3.基质溶解素；4.膜型金属蛋白酶。MMP-1 又称间质胶原酶，可降解Ⅰ型胶原和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型纤维胶原。MMP-2又称明胶酶A，是以ECM中的Ⅳ、Ⅴ型胶原及纤维粘连蛋白为主要底物。MMP-9可降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原明胶和弹性蛋白等多种底物。本研究发现MMP-1、MMP-2、MMP-9在胶质瘤中的表达明显增强，与对照组相比具有显著性差异。MMPs的表达与胶质瘤的恶性程度呈明显的正相关，其过度表达水平能反映出胶质瘤的高侵袭性的生物学特性。MMPs阳性的肿瘤细胞呈片状分布，且多位于肿瘤边缘或血管腔旁，这为肿瘤细胞向周边侵袭、 脱落又提供一理论依据。MMPs在高级别组和低级别组中的表达也具有显著性差异，与国内外报道的相一致[1-3，8,10]。这表明它们在胶质瘤的侵袭过程中扮演着重要的角色，本研究发现在高级别组中，大多数MMP-9表达为(+++)，提示MMP-9 在胶质瘤的侵袭生长中起更重要作用。

CD147是一个新的细胞表面粘附分子又名细胞外基质金属蛋白酶诱导因子，主要通过介导肿瘤细胞与间质细胞的相互作用,刺激肿瘤细胞本身和间质细胞分泌MMPs，降解ECM，促肿瘤细胞的侵袭和转移[4]。本研究结果显示CD147与胶质瘤的恶性程度及MMPS的表达呈明显的正相关，这说明CD147在胶质瘤侵袭性过程中起重要的作用。

金属蛋白酶抑制物(TIMPs)是MMPs的天然抑制剂，目前已发现 4 种:TIMP-1,TIMP-2,TIMP-3 和 TIMP-4。MMPs和TIMPs之间存在一定程度的特异性，TIMP-1能抑制大多数MMPs，但以选择性的抑制MMp-9为主，而TIMP-2以特异性抑制MMP-2为主。TIMPs对MMPs的抑制作用主要表现在两个方面，一是阻止MMPs酶原活化，二是抑制已活化MMPS的活性[5]。目前对于TIMPs在胶质瘤中的表达研究结果不一致，甚至互相矛盾[3.6.7,9]。在本次研究中发现TIMPs在胶质瘤中表达上调，但是但随着恶性肿瘤程度增加，TIMP2/MMP-2, TIMP-1/MMP-9的比值降低。这表明随着恶性肿瘤的程度增加，TIMPs相对于MMPs的分泌严重不足，MMPs的作用明显增强，导致肿瘤的高侵袭性。

总之，本实验结果表明，MMPs与胶质瘤的侵袭性生长密切相关， 其过度表达水平能反映出胶质瘤侵袭能力的生物学特性，它们的联合检测可以判断肿瘤的恶性程度、 侵袭能力。目前抑制基质金属蛋白酶的作用是已成为胶质瘤治疗的研究的热点，主要从二个方面着手：一是抑制其活性，二是抑制其产生的数量。如果以MMPs的诱导剂 CD147为靶点从根本上阻止其产生，以及辅助性的应用MMPs的抑制剂，来降低残留的MMPs酶的活性，可能会达到令人满意的治疗效果。

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