低氧预适应对小鼠海马组织细胞红蛋白表达的影响*

黄丽华 姜树原 张 胜 邵 国，2,3

(1.包头医学院生物医学研究中心 ，内蒙古 包头 014010；2.包头医学院生物化学及分子生物学教研室，内蒙古 包头 014010；3. 汕头大学医学院分析细胞学实验室，广东 汕头 515041)

低氧预适应(hypoxic preconditioning)是指1次或多次短暂、非致死性低氧刺激后,机体获得的对更严重甚至致死性缺血或缺氧的耐受性。预适应是机体抗缺氧或缺血的一种内源性保护现象,它不仅存在于多种动物的心脏,而且也存在于肝、肾和脑等多种组织、器官和细胞中[1, 2]。脑是对低氧最敏感的器官,但经过预适应后也可以增加对低氧的耐受[3]。与氧密切相关的运输和储存这一生理过程中，人们认识到血红蛋白和肌红蛋白的功能。2002年德国科学家Burmester在小鼠和人体内发现了第四种携氧球蛋白-细胞红蛋白[4]。大量文献表明细胞红蛋白与缺氧关系密切，但细胞红蛋白在低氧预适应中是否具有一定的作用，尚未见报道。本文通过复制小鼠急性重复低氧模型，诣在探讨低氧过程中小鼠海马中细胞红蛋白的变化和意义。

1 材料与方法

1.1动物模型复制 选择6～8周龄，体重18-22克的昆明种雄性小鼠有由内大动物室提供。按吕国蔚教授方法复制急性重复低氧预适应模型[5]。将小鼠置于含有新鲜鲜空气，经过标定约125 ml的广口瓶内，以橡皮塞密闭，记时、观察，待小鼠出现喘呼吸，翻转反射消失，立即取出，转移至另一相同容积并含有新鲜空气的广口瓶内，密闭、记时，如此重复4次。实验分3组：空白对照组(H0)、实验对照组(H1)、低氧预适应组(H4)每组15只，各组取出后立即断头，迅速取出海马并置于低温冰箱中保存。

1.2仪器与试剂 TRIzol试剂(GIBCO BRL),Fluoro DD试剂盒(Genomyx) 溴化乙锭(EB)、氯仿(重庆化学试剂厂)、异丙醇( 重庆化学试剂厂)、乙醇 (重庆化学试剂厂) PCR仪：PTC-100美国；紫外分光光度计(U-2800日本日立)电泳仪(DF-D北京)、紫外透射反射分析仪(H-UVIII上海康禾)、Real-time PCR仪(ABI 7900)．

1.3Real-time 用Triziol法提取总RNA,然后用反转录试剂盒将mRNA逆转录生成cDNA。取上述样本1μL为模板,上游引物和下游引物各1μL(10mM)，利用南京凯基Real- PCR试剂盒检测细胞红蛋白表达。以β-actin作为内参，循环条件为50℃，20min, 95℃，2min,95℃,20s,59℃ ，1min 扩增40个循环,最后72℃延伸7min。PCR引物序列如下：cytoglobin forward primer : 5-CCATCCTGGTGAGGTTCTTT-3【5 3右上角加撇】;cytoglobin backward primer: 5-CTTCCTTGTAGGCTGCGGT-3;β -actin forward primer:5 _ -GAACG GTGAAGGCGACAG-3;β-actin backward primer: 5 _ -TTGG GAGGGTGAGGGACT-3

2 结 果

2.1不同低氧次数小鼠耐受时间的比较。结果见图1,由图1可以看出随低氧次数的增加小鼠的低氧耐受性增强，经过4次低氧处理的小鼠组对低氧的耐受性显著提高。结果与以往发表文章相同[6, 7]。

图1 不同低氧暴露次数低氧耐受时间(注： 与低氧一次比较**P< 0. 01)

2.2Real-time PCR结果 通过real-time PCR检测发现，如图2所示，以β-actin 为内参得到各组相对值H0组为(23±4.9),H1组为(33.85±6.4), H4组为(38.6±10.24)。我们可以看出随低氧次数的增加细胞红蛋白mRNA表达呈逐渐增高的趋势。实验组小鼠海马组织细胞红蛋白mRNA的表达高于未经低氧的对照组。低氧预适应组小鼠海马组织细胞红蛋白mRNA的表达显著高于对照组，并有统计学差异(n= 3,P<0.05)

图2 Ratio of cytoglobin mRNA to beta-actin mRNA in the hippocampus (n=3,*,P<0.05 vs.H0 and H1)

3 讨 论

氧是机体代谢和维持生命的重要物质，在与氧密切相关的运输和储存这一生理过程中，人们认识到血红蛋白和肌红蛋白的功能。2002年德国科学家Burmester在小鼠和人体内发现了第四种携氧球蛋白-细胞红蛋白[4]。自从细胞红蛋白发现以来，缺氧与细胞红蛋白关系成为研究热点，但细胞红蛋白在急性低氧预适应的形成是否有作用尚未见报道。

本实验对在低氧预适应中细胞红蛋白是否发挥作用作出初步探讨。研究结果显示，低氧预适应形成的过程中，Cygb表达逐渐增加。其变化的原因可能是基于缺氧诱导因子-1 (HIF-1)的变化。我们先前研究发现急性重复低氧激活缺氧诱导因子-1 (HIF-1)[7]， 而Wystub等分析了Cygb启动子区的调控因子，发现Cygb具有与HIF-1特异位点起作用的低氧应答元件 (HREs)，并且在它的3’端非翻译区发现了保守的可经缺氧诱导的mRNA信号位点。因此在预适应形成的过程中，HIF-1促进了Cygb基因的转录，使细胞红蛋白得以高表达。Cygb表达增加可以通过以下几种机制对神经细胞保护：①Cygb同neuroglobin一样可以增加供氧量[8]，以利于神经细胞在缺氧环境中仍能摄取足够的氧气分子，以满足其功能的需要；②可以降低NO[9]，在缺氧/ 缺血期间产生过量NO 能激活周围(如突触前神经末梢和胶质细胞)的鸟苷酸环化酶,使cGMP 水平增高而产生毒性，对神经元存活有不利影[10]。由于Cygb能与NO紧密结合,有助于NO的清除[9]。③Cygb具有清除活性氧类物质的作用，脑缺血缺氧时,活性氧产生过多,自由基生成,细胞膜磷脂受其攻击导致脂质过氧化,细胞膜流动性降低、通透性增高,线粒体肿胀,溶酶体受损并释放等一系列变化。④Cygb具有作为NADH氧化酶的作用，在缺氧条件下促进糖酵解和ATP的生成，增加细胞供能，有助于维持正常神经元的功能。因此Cygb在低氧预适应小鼠海马中表达可能是低氧预适应的形成和脑组织保护的机制之一。

自从细胞红蛋白发现以来，尤其是细胞红蛋白在缺氧时表达会增加，有助于神经细胞对缺氧提高耐受性。我们对低氧预适应过程中是否细胞红蛋白发挥作用作出初步探讨。虽然细胞红蛋白在脑低氧预适应中作用机制尚不十分清楚，但是随着研究的日益深入，人类会认识这种潜在的机制，将会对临床医学、高原医学、运动医学和航天医学的发展起到推动作用。

[1] Webster KA, Discher DJ, Bishopric NH. Cardioprotection in an in vitro model of hypoxic preconditioning[J].J Mol Cell Cardiol, 1995,27: 453-458.

[2] Heurteaux C, Lauritzen I, Widmann C, et al. Essential role of adenosine, adenosine A1 receptors, and ATP-sensitive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 1995,92: 4666-4670.

[3] Kitagawa K, Matsumoto M, Tagaya M, et al. 'Ischemic tolerance' phenomenon found in the brain[J].Brain Res, 1990,528: 21-24.

[4] Burmester T, Ebner B, Weich B, et al. Cytoglobin: a novel globin type ubiquitously expressed in vertebrate tissues[J].Mol Biol Evol, 2002,19: 416-421.

[5] Lu GW. Tissue-cell Adaptation to hypoxia[J]. Advances in Pathophysiology, 1963,1: 197- 239.

[6] Shao G, Zhang R, Wang ZL, et al. Hypoxic preconditioning improves spatial cognitive ability in mice[J].Neurosignals, 2006,15: 314-321.

[7] Shao G, Gao CY, Lu GW. Alterations of hypoxia-inducible factor-1 alpha in the hippocampus of mice acutely and repeatedly exposed to hypoxia[J].Neurosignals, 2005,14: 255-261.

[8] Shao G, Gong KR, Li J, et al. Antihypoxic effects of neuroglobin in hypoxia-preconditioned mice and SH-SY5Y cells[J].Neurosignals, 2009,17: 196-202.

[9] Minning DM, Gow AJ, Bonaventura J, et al. Ascaris haemoglobin is a nitric oxide-activated 'deoxygenase'[J].Nature, 1999,401: 497-502.

[10] Xiao F, Fratkin JD, Rhodes PG, et al. Reduced nitric oxide is involved in prenatal ischemia-induced tolerance to neonatal hypoxic-ischemic brain injury in rats[J].Neurosci Lett, 2000,285: 5-8.