双重阻断肾素血管紧张素系统对糖尿病肾病大鼠肾小管间质纤维化的影响

刘伦志

湖北民族学院附属医院肾内科(湖北 恩施 445000)

肾小管间质纤维化是糖尿病肾病进展为终末期肾脏病(ESRD)的重要途径之一，也是影响糖尿病肾病残留肾功能和预后的重要因素。肾小管间质纤维化主要表现为以纤维连接蛋白(FN)为主的细胞外基质大量堆积，TGF-β和CTGF在这个过程中起着关键性作用；已有的研究发现血管紧张素Ⅱ转换酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素ⅡⅠ型受体拮抗剂(ARB)都能通过不同途径影响肾小管间质纤维化的发展，本文观察了两者联合应用双重阻断肾素血管紧张素系统(RAS)对肾小管间质TGF-β、CTGF、FN表达的影响。

1 材料及方法

1.1主要试剂链脲佐菌素(Streptozotocin ，STZ，美国Sigma公司)，氯沙坦(Losartan，杭州默沙东)，贝拉普利(洛汀新，北京诺华)，兔抗鼠 CTGF多克隆抗体、兔抗鼠 FN多克隆抗体(Santa Cruz公司)，兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体(购于北京中杉金桥生物技术有限公司)；生物素化二抗工作液、辣根酶标记的链霉素卵白素工作液(北京中杉金桥)，TRIzol RNA提取液(美国Invitorgen 公司)，RT-PCR试剂盒(美国Promaga公司)，TagDNA聚合酶(美国 MBI Fermentas 公司，PCR引物由上海生工合成。

1.2动物模型及干预8周龄清洁级健康纯种雄性Wistar大鼠60只，体重220～250 g，实验前大鼠空腹血糖<7.0 mmol/L，尿蛋白定性阴性，大鼠适应性喂养一周后，按60 mg/kg剂量行大鼠腹腔内一次注射STZ的方法诱导糖尿病模型大鼠，72 h后用One Touch Ⅱ血糖仪及配套血糖试纸采尾静脉血测定大鼠随机血糖，尿糖试纸测大鼠随意尿的尿糖定性；如大鼠随机血糖≥16.7 mmol/L、尿糖定性+++～++++，认为糖尿病模型制备成功。4周时，测定大鼠尿蛋白大于30 mg/L则认为糖尿病肾病模型成功。按体重随机分为对照组(A组)，贝那普利治疗组(B组)，贝那普利联合治疗组(C组)，各组20只。对照组每日给予清水灌胃，B组给予贝那普利10 mg/kg一次灌胃，C组按贝那普利5 mg/kg、氯沙坦10 mg/kg混合后灌胃。

1.3免疫组化在干预后第8周，大鼠称重后用10%水合氯醛按0.04 ml/kg腹腔内注射麻醉，迅速打开腹腔取出双肾，小心剥去肾包膜后左肾称重测肾重体重比，4℃生理盐水灌洗后沿纵轴对称剖开，取部分肾组织用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，待切片做HE染色和MASSON染色及免疫组化，取部分肾皮质液氮保存做RT-PCR。免疫组化按试剂盒说明书操作，阳性染色呈棕黄色。以PBS代替第一抗体的方法作为阴性对照；随机于肾皮质区采取5个不连续的不包含肾小球和动脉的肾小管视野(×400)，用Image-pro plus图像分析系统测定每个视野肾小管间质阳性表达面积与视野面积的比值，取其平均值。

1.4 RT-PCR 用Trizol一步法提取肾皮质总RNA，测量各组260 nm和280 nm紫外吸收值(A)，重复测定3次。结果各组A260/A280在1.8～2.0之间，说明所提RNA纯度高。根据A260值计算RNA浓度。取总RNA 2 μg作逆转录，试验步骤参照逆转录试剂盒说明书进行，取1 μg cDNA逆转录产物为模板，再利用特异性引物扩增目的片段。CTGF 引物上游5′-CTA AGA CCT GTG GAA TGG GC-3′，下游5′-CTC AAA GAT GTC ATT GCC CCC-3′，产物为383 bp；TGF-β1上游引物5′- GCG ACT CCT GCT GCT TT- 3′，下游引物5′- CTG GCG AGC CTT AGT TTG - 3′扩增产物大小为350 bpp；内参照β-actin，上游引物5′-GGC TAC AGC TTC ACC ACC AC - 3′，下游引物5′-TAC TCC TGC TTG CTG ATC CAC - 3′，扩增产物大小为498 bp，反应体系为25 μl。目的基因扩增条件如下：94℃ 预变性1 min，以后95℃ 变性1 min，56℃ 退火1 min，72℃ 延伸1 min，最后一次72℃延伸10 min。TGF-β1、CTGF共扩增35个循环， β-actin扩增28个循环。取5μl扩增产物在含EB的2%琼脂糖凝胶中电泳，采用Image-Pro凝胶成像系统，将其与β-actin条带强度的比值作为TGF-β1、CTGF表达量。

2 结果

2.1光镜下病理改变各组大鼠肾小管间质在光镜下均有不同程度病变， A组可见肾小管上皮细胞变性脱落，部分肾小管萎缩，间质灶性淋巴细胞浸润， B、C两组上述改变显著较A组轻；MASSON染色发现A组小管间质增宽，有明显的胶原沉积，B、C两组小管间质胶原较少，但两者之间的差异不显著。

2.2小管间质TGF-β1、CTGF、FN表达应用免疫组化观察各组大鼠肾小管间质TGF-β1、CTGF、FN表达，发现在肾小管上皮细胞胞浆、间质均有阳性表达，其中A组表达最明显，C组表达最少，与A组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与B组比较差异同样有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组肾小管间质TGF-β1、CTGF阳性表达相对面积(n=20)

与A组比较，△P<0.05，▲P<0.01，与B组比较※P<0.05

2.3肾皮质TGF-β1、CTGF mRAN表达RT-PCR结果显示A组TGF-β1、CTGF mRAN表达最明显，B组其次，C组表达最少，各组之间的表达差异有统计学意义(P<0.05)。图1，图2见封三。

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病最重要的并发症之一，近年的统计资料显示糖尿病肾病在ESRD的比例呈增加趋势，新发的糖尿病肾病相关的ESRD数量以近10%的比例增加[1]。其肾功能的丧失最主要的病理改变是肾小球硬化和肾小管间质纤维化，对糖尿病肾病小管间质纤维化机制和抗纤维化的研究有可能为糖尿病肾病的防治提供新的治疗靶点[2]。

肾小管间质纤维化的实质就是以FN、Col Ⅳ为主的细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡，导致大量ECM在小管间质堆积；其中FN作为一种高分子量糖蛋白，是ECM的主要成分，也是最早出现在损伤肾组织中的基质蛋白成分[3]。在肾小管间质纤维化过程中有很多的细胞因子参与，目前认为最重要的是TGF-β1和CTGF[4]。动物实验和肾活检资料都显示在肾小管间质纤维化的同时常常有TGF-β1和CTGF的高表达，体外细胞培养也证实，应用TGF-β1和CTGF刺激细胞能加速FN、Col Ⅳ等ECM的合成，当TGF-β1和CTGF被拮抗后ECM的合成显著下调。同时，TGF-β1作为小管间质纤维化的核心因子，还可能通过介导炎症、诱导凋亡、促进小管上皮细胞转化等途径促进小管间质纤维化的发生[5]。

RAS在糖尿病肾病小管间质纤维化中起着重要作用，RAS在肾组织中的表达比血浆中远远要高，应用ACEI或ARB在临床上能减少早期糖尿病肾病患者蛋白尿，延缓小管间质纤维化和肾小球硬化[6]。动物实验也发现，应用ACEI能减轻肾小球硬化和小管间质纤维化，下调TGF-β1和CTGF等促纤维化因子的表达，上调BMP-7等抗纤维化因子表达，对ARB的临床和实验研究也取得了类似的结果[7]。由于ACEI与ARB作用环节的不同，ACEI能够降低Ang Ⅱ合成，但由于存在非ACE途径合成Ang Ⅱ， 使得Ang Ⅱ水平能恢复到治疗前水平， 出现ACEI治疗中的“逃逸现象”；ARB主要阻断与Ang Ⅱ与AT1 R结合， 但是ARB并不能完全阻断Ang Ⅱ和其他受体结合，这可能导致ARB无法完全阻断Ang Ⅱ对肾脏的不利影响；理论上ACEI和ARB联合应用能从不同环节阻断RAS系统，生物学效应会更强，在动物实验和部分临床观察都发现二者联合应用能更好地减少蛋白尿和更容易使血压达标[8]，我们的结果也证实对TGF-β1和CTGF等促纤维化因子有更强的抑制作用，但2008年ONTARGET 研究显示大剂量联合ACEI和ARB虽能显著减少尿蛋白，但包括心脑血管实践和总体死亡率并没有得到预期结果[9]。其原因推测可能与入选病例的类型、RAS过度抑制使RAS有益的生物学效应也被削弱以及过度降压等因素有关。因此本研究选择了中剂量的贝那普利和氯沙坦联合应用，结果显示比单用常规剂量的贝那普利有更强的抑制促纤维化因子TGF-β1和CTGF表达作用，这也许能为临床糖尿病肾病的联合药物诊治提供一些新的靶点。

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