耐力运动对ApoE基因缺陷小鼠肝X受体a和三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因表达的影响

张洪侠，刘善云，周桂桐

●成果报告

耐力运动对ApoE基因缺陷小鼠肝X受体a和三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因表达的影响

张洪侠1，2，刘善云1，周桂桐3

目的：观察耐力运动对ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠肝脏肝X受体a（LXR-a）和三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）基因表达的影响及其在抗动脉粥样硬化中的作用。方法：将24只8周龄ApoE基因敲除小鼠随机分为AS模型组和运动干预组，每组12只，运动组进行14周跑台训练，实验持续14周后，采用普通PCR法测定肝脏LXR-a及ABCA1mRNA表达；采用HE染色法观察主动脉根部的病理变化。结果：运动组与安静组相比，LXR-a和ABCA1mRNA表达上调（P＜0.05），主动脉斑块及内膜损伤程度较对照组减轻。结论：耐力运动通过增加LXR-a和ABCA1mRNA的表达，而发挥抗动脉粥样硬化的作用。

耐力运动；ApoE基因缺陷小鼠；动脉粥样硬化；LXR-a；ABCA1

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是导致心脏病的首要原因，也是糖尿病和肥胖症的一种常见并发症，严重危害人们的生命和健康。它不仅是动脉自身的疾病，而且也是导致心肌梗塞、脑梗塞和肢体功能丧失的主要原因，是心脑血管病的主要病理基础。近年研究表明，肝X受体（LXRs）与AS的发生发展密切相关，并且得到大量研究证实[1－2]。肝X受体（LXRs）是核受体超家族的成员之一，因肝脏表达最丰富而命名。LXRs有二种亚型LXRa、LXRβ，其中LXRa与AS的发生密切相关。

运动医学界大量研究表明，运动是防治AS的有效措施之一。但运动究竟通过何种机制发挥抗AS的作用研究较少。本研究试图通过观察运动对小鼠LXRα影响的研究来探讨其抗AS的可能机制。目前国内外对LXRs的研究仍集中在药物及其激动剂对AS的影响方面，而结合运动加以研究的还未见报道。本实验目的在于研究耐力运动对LXRα、ABCA 1表达的影响及其在防治AS中的作用，以进一步阐明运动抗AS的可能机制。

1 研究材料与方法

1.1 主要试剂及设备

TRIzol（Invitrogen，美国），RT试剂盒（invitrogen公司），PCR试剂盒（上海生物工程公司）。LXRα，ABCA1和β－Actin引物（上海生物工程公司合成），其他试剂均为进口或国产分析纯。垂直电泳仪及转膜系统（美国Bio－Rad），PCR仪（美国伯乐）等。

1.2 实验动物及训练方案

选用24只雄性8周龄基因敲除小鼠，体重（20±2）g，由北京大学医学部实验动物中心提供。小鼠按组分笼饲养，自由进食饮水，饲以“西方类型”膳食（胆固醇含量为0.15%，脂肪含量为21%），实验期间，室内温度基本控制在（20～25）℃，湿度60%左右，每天定时通风。

1.3 实验取材

实验结束后，运动组在末次训练48 h后和其对照组取材，打开胸腹腔，冲洗后，迅速取出小鼠心脏（包括主动脉弓）放置于4%的多聚甲醛中进行固定后，20%蔗糖固定过夜，OCT包埋，－70℃保存，以备做冰冻切片；再迅速取出肝脏，放置于液氮中，－70℃保存，用于测定mRNA的表达。

1.4 实验方法及指标的测定

1.4.1 小鼠主动脉窦典型动脉粥样斑块的结构观察（HE染色）采用小鼠冰冻切片的苏木素－伊红（hetamoxylin－eosin，HE）染色，取小鼠主动脉窦冰冻切片，蒸馏水冲洗6 min，苏木素染色2 min，蒸馏水多次冲洗，伊红染色1 min，95%酒精分色脱水3次，100%酒精2次各2 min脱水，二甲苯脱水2次各5 min，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.4.2 逆转绿聚合酶链反应法测定LXR-a和ABCA1mRNA的表达 采用Trizol试剂抽提肝细胞总RNA，与紫外分光光度计下测定260 nm和280 nm波长A值两者比值为1.6～1.8，表示RNA纯度高，并于1%琼脂糖凝胶电泳（1×TAE缓冲液）鉴定RNA完整性。将RNA稀释到1 μg/μL，用逆转录试剂盒（Qiagen公司）合成cDNA。采用Primer Express 2.0软件设计LXRα、ABCA1和β－actin基因的上游和下游引物。RNA逆转录按试剂盒进行，生成的cDNA按以下反应体系进行PCR扩增。PCR总反应体积25 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。以β－actin为内参照进行PCR扩增.PCR扩增引物及产物长度为：（1）LXRα：上游引物5'－AGGGATAGGGTTGGAGTCAGC－3'，下游引物5TGAGCCTG TTCCTCTTCTTGC3，扩增片段为402。ABCA1上游引物5－CCT GTT TCC GTT ACC CGA CTC－3，下游引物5－ACA GGC GAG CCA CAA TGG－3，扩增片段 557。Beta－Actin上游引物5CCATCTACGAGGGCTATGCT3，下游引物5CAAGAAGGAAGG CTGGAAAA3，扩增片段311 bp。LXRα、ABCA1及β－actin扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，30次循环后，再行72℃延伸7 min.取PCR产物5 μL于琼脂糖凝胶中电泳，用全自动凝胶分析系统灰度扫描分析，并计算LXRα/β－actin和ABCA1/β－actin值比，代表LXRαmRNA和ABCA1mRNA的表达。

1.5 数据处理

所有数据均有SPSS统计软件（SPSS16.0）处理，数据以均值±S表示，数据呈正态分布时，采用独立样本T检验，P＜0.05为有统计学差异。

2结 果

2.1 小鼠主动脉病理形态的变化

主动脉窦切片经HE染色，显微镜下观察发现，主动脉管壁薄厚不均，内膜增厚，内膜下间隙增宽，可见大量的泡沫细胞，也可见纤维期病变，有的纤维帽较薄，纤维帽下为大量的粉染的无定形和针状空隙（胆固醇结晶），脂质核心较大，与管壁粘附不紧密，有脱落现象。中膜平滑肌受压，萎缩，排列紊乱。有内弹力板断裂、甚至消失现象。但与模型组相比，运动组小鼠主动脉病变相对较轻，AS斑块面积相对较少，且多处在病变的早期阶段。表明耐力运动有效地抑制ApoE－/－小鼠AS病变的发生发展（见图1）。

2.2 各组小鼠主动脉LXRa 和ABCA1的变化

本研究显示，经14周耐力运动训练后，运动组小鼠肝脏LXRaRNA和ABCA1mRNA表达水平明显高于模型组（P＜0.05），提示运动上调了LXRa mRNA和ABCA1mRNA表达（见表1）。

表1 耐力运动对肝脏LXRaRNA和ABCA1mRNA表达影响的比较（±S）

表1 耐力运动对肝脏LXRaRNA和ABCA1mRNA表达影响的比较（±S）

注：＃与模型组相比P＜0.05。

组别 LXRa（灰度值） ABCA1（灰度值）C组 0.189±0.016 0.339±0.047 E组 0.335±0.07＃ 0.595±0.164＃

3 讨 论

近年来，有关AS干预手段及其机制的研究日益受到关注。本研究对运动干预ApoE－/－小鼠AS形成及作用机制方面进行深入探讨，并获得一些有益的结果。

AS病因复杂，其中胆固醇逆转运与AS发生发展有密切关系[7]，而LXRa和ABCA1是实现胆固醇逆转运的两个关键调控者。LXRa为配体依赖性核受体，必须与相应的配体结合后才能被激活[8－9]，其最有效的内源性配体是胆固醇的衍生物即氧化固醇。LXRa作为维持细胞内胆固醇相对稳定的关键感受器，它通过调节靶基因的表达进而影响胆固醇的代谢与转运的多个环节[10]，ABCA1是典型的LXRa靶基因，受其调控。在ABCA1启动子区域有LXR反应元件[11]，它以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，在胆固醇逆转运和高密度脂蛋白（HDL）生成的起始步骤中起重要作用[12]，被称作胆固醇逆转运的守门人。激活的LXRa通过调控其下游靶基因ABCA1的表达，发挥抗AS的作用。本研究采用易于形成AS的ApoE－/－小鼠复制AS模型，以便探讨运动、LXRa与AS之间的关系。

根据本实验结果显示，8周龄ApoE－/－小鼠经“西方类型”膳食喂养14周后，主动脉根部已形成典型的AS斑块。AS模型组主动脉内膜明显增厚，内皮下间隙增宽，可见大量泡沫细胞形成的脂纹期以及纤维化期病变。而经过14周耐力运动干预后ApoE－/－小鼠AS的形成及病变程度较模型组明显减轻，大多停留在病斑的早期阶段。此外，袁凌燕[13]等研究也发现，8周龄ApoE－/－小鼠经“西方类型”膳食喂养至20周时，实验动物形成典型的AS病变，而经12周有氧运动后，运动组AS斑块面积较对照组显著减少。提示有氧运动有效地抑制或延缓了ApoE－/－小鼠AS的形成。

本研究发现，运动组LXRα和ABCA1灰度值明显高于模型组（P＜0.05），说明运动作为一有效手段提高了LXRα和ABCA1基因表达，结合两组实验动物主动脉病理形态的变化可推测，运动有效抑制AS发生发展可能是通过上调LXRα和ABCA1基因表达而发挥抗AS作用。

耐力运动究竟是通过何种途径来影响LXRα基因表达，目前尚未见到相关文献报道。作者认为可能与以下机制有关：其一，由于运动增加胆固醇流出[14]产生大量的氧化甾醇，氧化甾醇是LXRα的天然配体，LXRα与配体结合后被活化，由于大量的LXRα被活化，进而激活其下游靶基因ABCA1的表达，增强胆固醇的逆转运过程，从而降低AS的发生发展；其二，耐力运动促进LXRα基因表达可能与运动加快血流速度、增加血管壁切应力有关。管壁切应力增加可通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、甾醇27－羟化酶（sterol27－hydroxylase，CYP27）依赖方式上调LXRα及其部分靶基因的表达，从而起到保护血管内皮细胞的作用。由此可见，耐力运动可能通过增加氧化固醇含量、加快血流速度、提高血管壁剪切力等方式，增加LXRα基因表达，从而延缓AS病变的发生与发展。

4结 论

14周耐力运动能有效地增加ApoE－/－小鼠肝脏LXRα和ABCA1mRNA表达，从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。

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Effect of Endurance Exercise on LXRa andABCA1 gene expression in Apoe-Deficient Mice and Its Intervention from Atherosclerotisis

ZHANG Hongxia1，LIU Shanyun2，ZHOU guitong3
（1.Dept of health&exercise，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China；2.Dept.of Clinical Training，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Dean's office，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

Objective：To investigate the effects of endurance training on expressions of LXRα and ABCA1in in ApoE－deficient mice and to explore the relation of LXRα with Atherosclerosis.Eighteen 8－week old ApoE－deficient mice were selected and divided into atherosclerosis model group and exercise group randomly.There were twelve mice in each group.Mice of exercise group were trained on treadmill for fourteen weeks.The LXRα and ABCA1mRNA of liver were determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction（PCR）.The pathological change were determined by HE staining.Results：The expression of LXRα and ABCA1mRNA were significantly increased（P＜0.05）in ApoE－deficient mice with endurance exercise.The degree of lesion in aorta wall and tunica intima was lighter in ApoE－deficient mice with endurance exercise.Conclusions：The present study demonstrated that endurance exercise may contribute to its anti－atherosclerosis function by significantly increasing LXRα and ABCA1 mRNA.

enduranceexercise；ApoE－deficient mice；atherosclerosis；LXRα；ABCA1

G 804.7

A

1005-0000（2010）06-0486-03

2010-09-09；

2010-11-18；录用日期：2010-11-22

天津市科技计划项目（项目编号：08JCYBJC06000）

张洪侠（1978-），女，安徽宿州人，助理实验师，研究方向为运动与健康促进。通讯作者：刘善云（1958-），女，天津市人，教授，博士，研究方向为运动与健康促进。

1.天津体育学院健康与运动人体科学系，天津300381；2.天津中医药大学临床实训教学部，天津300193；3.天津中医药大学教务处，天津300193。

小鼠适应性喂养一周后，随即分为两组，分别为模型组（C组）和运动组（E组），每组12只，各实验组间无显著性差异，运动组进行中等强度的跑台训练：跑台速度为13 m/min，每天1 h。以1周为1单元，每周训练5次，参考ApoE－/－小鼠运动量[3－6]。