ＣＫ－１９ｍＲＮＡ在乳腺癌患者骨髓中的表达及临床意义

方文成　崔红侠　张传平

[摘要]目的 检测乳腺癌骨髓中CK-19mRNA的表达,探讨其在乳腺癌微转移中的临床意义。方法 采用RT-PCR方法检测95例乳腺癌患者和15例乳腺良性疾病骨髓中CK-19mRNA的表达。结果 95例乳腺癌中,51例(53.7%)骨髓中检测出CK-19mRNA的表达。CK-19mRNA阳性表达率与乳腺癌临床分期和肿瘤大小有关(P<0.05),而于月经、腋淋巴结转移状况、ER、PR蛋白的表达均无显著性相关(P>0.05)。CK-19阳性病人的局部复发率、远处转移率与CK-19阴性病人比较,差异有显著意义(P<0.05)。结论 CK-19mRNA可作为乳腺癌骨髓微转移指标之一,骨髓微转移的检测能够更好地指导临床分期和评估预后。

[关键词]乳腺癌;骨髓;微转移;CK-19

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号]1004-8650(2009)10-014-02

乳腺癌是一种全身性恶性疾病,影响其预后的主要因素是全身转移。骨髓内血管为独特的窦状结构,有浓缩或使癌细胞停留的作用,因此骨髓是乳腺癌最容易发生远处转移的部位。研究发现,约30%腋淋巴结阴性的乳腺癌患者术后5年内出现复发、远处转移而导致死亡,其主要原因是淋巴结、骨髓及血液中微转移灶的存在[1]。我们通过应用RT-mRNA技术,以细胞角蛋白19(Cytokeratin-19, CK-19)为标志,检测乳腺癌患者骨髓中的微转移状况,探讨其在乳腺癌微转移中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2002年6月-2007年10月在我科住院的乳腺癌患者95例,均为女性,平均年龄27-65岁,中位年龄48.5岁。其中Ⅰ期12例,Ⅱ期47例,Ⅲ期36例。腋窝淋巴结转移阳性59例,阴性36例,绝经前52例,绝经后43例。所有患者均经手术治疗,术后病理类型:浸润性导管癌 61例,浸润性小叶癌23例,髓样癌 7例,黏液腺癌4例。术前所有患者均未行放疗、化疗等治疗,并经胸部X线、B超、CT和骨扫描等检查未发现明显转移灶。同期15例乳腺良性疾病作对照。

1.2 标本采集

乳腺癌患者术中经皮下抽取胸骨骨髓6-8ml,乳腺良性疾病经皮肤抽取骨髓6-8ml,肝素抗凝后,用生理盐水稀释,然后淋巴细胞分离液离心,收集淋巴细胞层,PBS洗涤,加入Trizol试剂1ml,-70℃保存备用。

1.3 实验方法

1.3.1 RT-PCR扩增:使用美国ABI公司AB15700型PCR扩增仪,美国BIO-RAD公司PowerPac Basic型凝胶成像系统。骨髓中 RNA提取、cDNA合成、PCR试剂均由上海生工生物有限公司提供,实验方法参考试剂说明书。CK-19的上游引物为5'-AGGTGGATTCCGCTCGGGGCA-3',下游引物为5-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA-3',扩增产物片段长度为460bp。内参照β-actin上游引物为5'-ATCTGGGACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3',下游引物为5'-CGACATACTCGTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3',扩增产物片段长度为838bp。RT-PCR热循环反应的条件为95℃ ,预变性5 min,95℃ 接链45s,55℃ 退火30s,72℃ 延伸55s,32个循环,72℃ 末次延伸5min。

1.3.2 结果判定:取PCR产物6μl行2%琼脂糖(含溴化已锭0.5μg/ml)凝胶电泳,在DNA Maker 指示下,以β-actin(838bp)做为阳性对照,在凝胶电泳中可出现460bp的条带即为CK-19表达阳性,为骨髓微转移阳性。

1.4 统计学处理

采用SPSS10.0软件包对数据进行χ2检验。

2 结果

2.1 CK-19mRNA在骨髓中的表达情况(见图1)

95例乳腺癌患者骨髓中CK-19mRNA的表达阳性者51例,占53.7%,15例乳腺良性疾病骨髓中无一例表达CK-19mRNA,差异有显著性意义(P<0.05)。

M:DNA条带(100-1000bp);1.阴性对照;2.阳性对照;3. CK-19mRNA表达阳性;4. CK-19mRNA表达阳性阴性

2.2 骨髓中CK-19mRNA的表达与传统预后指标的关系(见表1)。

CK-19mRNA阳性表达率与乳腺癌临床分期和肿瘤大小有关(P<0.05),而与月经、腋淋巴结转移状况、ER、PR蛋白的表达均无显著性相关(P>0.05)。

2.3 骨髓CK-19mRNA的表达与术后局部复发和转移的关系

截至2007年9月,全组患者随访37-61个月,中位随访时间49个月。95例乳腺癌中13例出现局部复发和转移,其中CK-19mRNA表达阳性组11例,占21.6%(11/51),CK-19mRNA表达阴性组2例,占4.55%(2/44),两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

乳腺癌目前已被广泛认为是一种全身性恶性疾病,即在早期即可发生血行播散,影响乳腺癌预后的主要原因是远处的转移。特别是淋巴结、骨髓及血液中微转移灶的存在。因此,早期发现淋巴结微转移有着重要的意义。乳腺癌微转移是指常规病理学检查检测不到的存在于患者淋巴结、血液及骨髓等体内的微小转移灶。它常以单个细胞或微小细胞团的形式存在,并在一定的条件下分裂增殖成转移灶。

检测骨髓微转移的常用方法是RT-PCR技术,能够快速扩增肿瘤细胞内特异性mRNA的表达,可从10⁶-10⁷个细胞中检测出一个肿瘤细胞,并预示肿瘤的微小转移,具有病理组织学和免疫细胞化学技术所不可比拟的敏感性[2]。角蛋白19(Cytokeratin,CK-19)是一种针对上皮细胞的单抗,是上皮性细胞的标志基因,仅在正常乳腺细胞和乳腺癌细胞中表达,而不在淋巴细胞、骨骼和外周血中表达。本组95例乳腺癌患者的骨髓中有51例表达CK-19 mRNA,其阳性率53.7%。而乳腺良性疾病患者中无一例表达,两组具有统计学意义(P<0.01) 。表明它可作为乳腺癌骨髓微转移的指标有一定的特异性。

本组结果显示,乳腺癌骨髓中CK-19阳性表达率随临床分期及肿块的大小的增加而增高。乳腺癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期骨髓中CK-19mRNA的表达阳性率分别为33.3%、44.7%和72.2%,差异有显著性,提示肿瘤分期越高转移的可能性越大。而且肿块>2cm者CK-19阳性表达率较≤2cm者也明显增高,值得注意的是,在肿块≤2cm及Ⅰ期乳腺癌患者中不同程度的骨髓微转移,说明乳腺癌是一个全身性疾病,早期即可发生远处转移。但是腋淋巴结转移阳性组与阴性组之间CK-19阳性表达率无明显差别(P≤0.05),表明乳腺癌血行转移与腋淋巴结转移为两条不同的转移途径,肿瘤细胞早期即可进入血液发生全身转移。

近年来报道显示,微转移的临床意义尚有争议,但至少可揭示其具有转移倾向,并可判断患者的预后[3]。 Stathopoulou等[4]认为乳腺癌微转移检出与无瘤生存率和总生存率相关,是判断预后的主要指标。本研究显示,CK-19mRNA表达阳性与CK-19mRNA表达阴性比较,两组术后局部复发和转移发生率差异有统计学意义(P<0.05),说明微转移的检测也是判断预后的主要指标之一。Braun[5]等检测552例乳腺癌骨髓微转移患者,发现CK-19mRNA表达阳性和局部复发、远处转移有明显相关性,辅助化疗可有效降低患者复发的危险,是判断预后的独立指标。因此,对检出有微转移的患者,在其发展成临床转移之前,给予积极辅助治疗,可以降低患者的复发率和转移率。

参考文献:

[1] Cqrcorofo P,Bergossi L,Basaqlia E,et al.Prognostic and therapeutic impact of sentinel node micrometastasis in patients with invasive breast cancer[J].Tumori,2002,88(3):S4-5.

[2] Von Kenbel Doeberitz M,Lacroix J. Nucleic acid based techniques for the detection of rare cancer cells in clinical samples[J].Cancer Metastasis Rev, 1999,18(1):43-64.

[3] Xenidis N,Vlachonikolis l,Mavroudis D,et al.Peripheral blood circulating cytokeratin-19 mRNA-positive cells after the completion of adjuvant chemotherapy in patients with operable breast cancer[J].Ann Onco, 2003 ,14(6):849-855.

[4] Stathopoulou A,Vlachonikolis I,Mavroudis D,et al.Molecular detection of cytokeratin-19-positive cells in the peripheral blood of patients with operable breast cancer: evaluation of their prognostic significance.J Clin Oncol,2002,20(16):3404-3412.

[5] Braun S,Pantel K, Muller P, et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer[J]. N Engl J Med,2000,342(8):525-533.

(收稿日期2009-06-30)