神经干细胞移植对损伤鼠脑ＳＴＡＴ３蛋白和ｂｃｌ－２蛋白表达水平的影响

周凤刚　郑永日　解洪军　吕　鸥　赵　岩　李青松　王建交

[摘要]目的 通过试验检测神经干细胞移植后SD大鼠机械性脑损伤局部STAT3蛋白和bcl-2蛋白表达水平的变化,来研究移植入的神经干细胞对损伤后神经细胞的凋亡抑制作用和可能的机制。方法 SPF级SD大鼠40只,随机分为4组,每组10只。取孕14天的SD胎鼠脑皮质神经干细胞培养至第三代,于损伤后的24小时立体定向注射植入成年SD大鼠脑损伤局部。于移植24小时后取脑组织,免疫组化检测bcl-2蛋白和Western blot法检测STAT3蛋白表达的变化差异,进而观察神经干细胞对细胞凋亡的抑制作用。结果 移植入神经干细胞后,局部STAT3蛋白和bcl-2蛋白的表达都比对照组明显的增强,差异具有统计学意义。结论 移植入的神经干细胞通过上调STAT3蛋白和bcl-2蛋白的表达,发挥抑制局部神经元的凋亡作用,可将其作为脑损伤的治疗方法进一步加以研究。

[关键词]神经干细胞;脑损伤;bcl-2蛋白;STAT3蛋白;细胞凋亡

[中图分类号]R617 [文献标识码] A [文章编号]1004-8650(2009)10-01-04

近年来神经干细胞移植的研究取得了令人瞩目的成绩,被公认为是治疗不可逆性神经损伤的最有效的方法。神经干细胞移植在脑损伤的动物脑内通过多种途径的明显改善神经功能[2]。本实验通过早期分化的神经干细胞移植于脑损伤的动物脑内,取得了同样有效的结果。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠(由哈尔滨兽业研究所提供)。1×PBS液(自配),0.25%的1∶250胰酶PBS溶液,D-hanks 液(自配),胎牛血清(Gibico),B27添加剂(Gibico)b-FGF,碱性成纤维细胞生长因子(PEPROTECH Asia),EGF,表皮细胞生长因子(PEPROTECH Asia)DMEM培养液(Gibico)20%血清的DMEM培养液,细胞冻存液(20%胎牛血清、12%无菌甘油、68%神经干细胞培养液),神经干细胞培养液(含有2% B27,EGF20ng/ml,b-FGF 20ng/ml的DMEM液)鼠立体定向仪(Narishige公司产品),相差倒置显微镜(OLYMPUS公司产品)。

1.2 方法

1.2.1 神经干细胞的培养分化及BrdU标记:取孕14天的SD大鼠,断头处死孕鼠,75%酒精浸泡10分钟。无菌手术剖腹产取出胎鼠,放于盛有D-hanks液的95cm2培养皿中断头,取脑。无菌条件下剥除脑膜及血管,分离大脑皮质配制成神经干细胞单细胞悬液用含bFGF(10ng/ml)和EGF(20ng/ml)并添加B27的DMEM/F12(1∶1)的细胞培养基培养,2-3天半量换液一次,7天传代,将传代培养第7天的细胞球吹散离心,换成含10%优级胎牛血清的DMEM/F12细胞培养基中分化培养,取部分加入BrdU (20umol/L)培养3天,用胰酶消化贴壁细胞,并制成浓度为1×10,⁵细胞/100μl的细胞悬液备移植,行nestin免疫细胞化学染色鉴定。

1.2.2 动物模型的制作[9] :300g清洁级SD大鼠,10%水合氯醛腹腔麻醉试验用鼠,俯卧位固定于手术台上,颅顶部剪毛,消毒、铺孔巾。颅顶正中线矢状切开头皮,以前囟后2.0mm、矢状缝旁开2.0mm为中心,牙科钻钻开直径为2.0mm的骨孔,保持硬膜完整。机械打击致伤,伤后大鼠出现短暂的四肢抽搐、呼吸停止,瞳孔散大,持续时间约3-5秒钟后醒转。充分止血后骨蜡封闭骨孔,缝合头皮。自然苏醒,自由饮食。

1.2.3 实验分组及细胞移植:将剩余的36只大鼠随机分成4组,每组9只。在模型制备后第1天行靶点细胞移植,10%水合氯醛腹腔麻醉试验用鼠,将生理盐水重悬的神经干细胞悬液(2×10⁸个/ml)应用微量注射泵以正三角形用微量注射器分三点注入硬膜下2.0mm深度。注射总量为6μl,注射时间为每点5min,留针5min后5min内缓慢退针。完成后骨蜡封闭骨孔,缝合头皮,自然苏醒,自由饮食。对照组用生理盐水代替细胞悬液,其他操作相同。

1.2.4 大鼠脑灌注固定及取材

1.2.4.1 免疫组化取材:10%水合氯醛将大鼠麻醉后开胸,经左心室至主动脉插管,并以止血钳固定,同时止血钳夹闭降主动脉,剪开右心耳,先快速灌注预冷的4℃生理盐水100ml左右,然后灌注4℃的4%多聚甲醛PBS缓冲液300-400ml。断头取脑,脑组织置于4%多聚甲醛PBS缓冲液固定24h,用于免疫组织化学染色。

1.2.4.2 免疫组化检测bcl-2蛋白表达含量,封片显微镜下观察,照相,胞浆着色呈棕黄色为阳性细胞。

1.2.5 Western blot 取材

10%水合氯醛麻醉后迅速断头取脑。冰台上分离损伤侧脑组织。冰生理盐水冲洗后,5ml冻存管封装,放入液氮保存。

1.2.6 Western blot 检测STAT3蛋白

①提取蛋白;②聚丙烯酰胺电泳;③配置凝胶;④蛋白电泳;⑤蛋白转膜;⑥PVDF膜封闭;⑦抗体孵育;⑧蛋白显色;⑨图像采集:应用图像分析系统采集并分析蛋白条带。

1.2.7 统计学处理

全部资料采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析,各组数据均以均数±标准差表示在高倍物镜下,取每张切片中损伤灶边缘区域相互不重叠的4个视野,计数其中阳性细胞总数,采用方差分析和组间t检验,比较各组间bcl-2蛋白阳性细胞数和STAT3蛋白强度面积。P<0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 细胞培养结果

各个时间点细胞培养的照片

3 讨论

神经干细胞作为神经发育的起始细胞,近年得到了广泛的研究并成为热点。其具有的自我更新能力和多分化潜能并通过分泌、激发损伤细胞的潜能而改变损伤区微环境[1]以此完成神经系统的修复作用已得到共识。随着神经干细胞体外培养技术的成熟,使得人们更加想通过外源性的移植入神经干细胞来治疗神经系统的损伤。现在已经有大量的动物实验证实了其可行性和有效性,其确实能够改善动物的行为功能活动。

脑损伤发生后,受损的局部脑组织在外力的机械作用下首先发生结构的破坏和血管及细胞的碎裂、死亡,进而细胞缺血缺氧,代谢紊乱,肿胀和增加死亡。其后又会因血液的重新灌注发生缺血再灌注损伤,而且在损伤区的半暗带更为显著,此时的细胞既可以是发生坏死也可以发生调亡。神经干细胞的抗损伤作用主要有以下的两个方面:一是外源性神经干细胞的移植可以重建受损的神经元回路。二是还可以通过移植细胞分泌神经营养因子起到神经保护作用。

本试验通过自孕14天的SD大鼠内剖腹产取胎鼠脑进行神经干细胞的原代培养,经nestin抗原免疫组化鉴定确为神经干细胞后,[3]行鼠脑损伤区细胞移植。然后取脑进行检测发现局部的Stat3蛋白和bcl-2蛋白的表达量明显的高于非神经干细胞移植组,而二者在细胞的凋亡发生过程中具有重要的作用。

Stat3是白细胞介素-6(IL-6)信号传递中的急性期反应因子(acute-phaseresponsfactor,APRF)被纯化的。编码Stat3的基因在鼠科动物定位于第11号染色体,在人类定位于第12号染色体(q13至q14-1)。[7,8]Stat3mRNA(碱基对约5kb),广泛表达于不同类型的细胞和组织中,参与细胞生长、恶性转化、凋亡等生理功能的调控。在不同的细胞系中,Stat3蛋白的活化具有介导细胞增殖和诱导凋亡双重作用。[8]Stat3靶基因产物包括影响细胞凋亡的bcl-2家族成员bcl-2与bcl-xL,是bcl-2家族蛋白成员中主要的抑凋亡分子。bcl-xl基因启动子上存在多个Stat3结合位点,Stat3可直接与bcl-xl启动子结合而启动转录,琌rintani等[4]研究发现在某些情况下,则可能通过诱导bcl-2、bcl-xl等基因的表达而具有抗细胞凋亡的作用。bcl-2是在哺乳动物中最早发现的与凋亡有关的基因。bcl-2基因编码一个25-26kD的膜蛋白,位于线粒体、核膜和内质网[2]。在各种正常细胞的激发和发育过程中表达,而在成熟或走向凋亡的细胞中不表达或低表达。其C末端的21个疏水氨基酸组成一个延伸的链状结构。可插入到细胞的膜结构中,这一结构特点与其调节细胞凋亡的方式和能力非常有关。首先,TBI后轴索崩解,轴索运输的营养因子减少,神经细胞因为缺乏营养因子而凋亡,而bcl-2蛋白的过表达可阻止神经细胞因缺乏营养因子而致的凋亡。其次,研究证明,线粒体外膜通透性的改变可引起细胞凋亡,而这种通透性的改变直接由bcl-2蛋白家族控制[5]。细胞色素C(cyt-c)自线粒体外膜上形成的蛋白孔道释放入胞浆是诱导细胞凋亡的关键环节。bcl-2家族对cyt-c的释放具有最明显的调控效应。通过本试验我们观察到随着神经干细胞的植入,损伤局部的Stat3蛋白和bcl-2蛋白的的表达量发生了增强,这充分的表明移植的神经干细胞参与了脑损伤的过程,也表明损伤的局部环境对植入的神经干细胞产生了影响。在脑损伤后24h内兴奋性氨基酸、钙离子、氧自由基以及细胞炎症因子在细胞外间隙明显增加,而移植后NSCs具有产生或分泌神经营养因子的作用,可促进自身的分化和TBI后的神经系统功能的恢复。实际上增加了脑组织的抗损伤的能力,从分子水平增加了抗凋亡的成分,稳定了线粒体,减少细胞的凋亡。这可能只是神经干细胞移植对脑损伤治疗作用的一个方面。但减少了原位神经细胞的损失,也就是降低了损害的程度,这是有着非常重要的意义。但是人们同时也发现脑外伤12h以后,各种神经营养因子分泌也逐渐下降,而神经营养因子对于神经干细胞的增殖、分化和迁移都起到重要的作用。另外,受伤时间越长,损伤灶内胶质瘢痕结构就越紧密,这不利于神经干细胞生长,同时也使其更难参与修复过程。综合以上本实验选择了24小时进行神经干细胞的移植,尽量的使其发挥更大的作用。同时希望本实验能对脑外伤的临床救治提供有益的线索,在脑外伤尤其是脑组织出现明显的破坏的外伤以及脑外科术后的脑组织副损伤患者的治疗开辟新的思路,即在其发生后的24小时进行神经干细胞的移植,减少脑细胞的死亡数量。改善患者的预后。神经干细胞移植后提高了损伤局部的Stat3蛋白和bcl-2蛋白的表达量,但其确切的机制尚有待进一步的研究。是神经干细胞的细胞因子的大量分泌激活了局部神经元的基因表达,各种抗凋亡的蛋白类分子数量增加?还是仅仅因为对Stat3蛋白起到了上调作用,再由后者进一步的引起bcl-2基因的活化,bcl-2蛋白随后增多?[6]细胞的凋亡是一个复杂的网络过程,bcl-2基因家族、caspase基因家族、NF-κB、P53基因等都参与了细胞的凋亡,是否神经干细胞对其都有作用,还是有选择的作用于脑损伤后凋亡调控的某一个或几个方面?如何确定更有效的神经干细胞移植量将是值得进一步研究的问题。研究神经干细胞增殖、分化、移植变化和影响的机制的最终目的是应用神经干细胞治疗疾病。人们正在进行这各个方面的探索,神经干细胞必将成为神经科学工作的有用工具而不断的发展,更好的为人类服务。

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(收稿日期2009-07-09)