心肌肌钙蛋白I检测方法的分析和进展

袁文华

众所周知,心血管疾病是威胁人类健康与生命的头号杀手,高发病率、高致残率、高死亡率及较高的治疗费用已使其成为阻碍社会发展的一大障碍。急性心肌梗死(AMI)是冠心病中的一个非常严重的类型,为冠状动脉闭塞、血流中断,使部分心肌因严重而持久的缺血发生局部坏死,从而导致心脏功能的严重损害,具有较高死亡率较高。对于急诊胸部不适疑为心肌梗死的患者,目前多用心电图结合心肌损伤标志物如肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(Mb/Myo)及心肌肌钙蛋白(cTn)I或T等进行诊断与鉴别诊断。近年来,随着患病率的提高,关于心肌梗塞诊断的研究也更充分。随着研究的深入,目前认为肌钙蛋白是检测心肌损伤的黄金指标[1-3]。

1结构特性分析

肌钙蛋白-I以三种形式存在,分别与快收缩骨骼肌、慢收缩骨骼肌和心肌中的特异性同种异型体相对应。骨骼肌的同种异形体在分子大小上相似,大约20 000道尔顿,然而氨基酸序列40%都不同。心脏同种异型体也显示与骨骼肌同种异型体有40%不同,但在氨基酸末端另有31个残基,使其分子量大约为24 000 道尔顿[4-5]。

心肌肌钙蛋白I在心肌梗死症状出现后的几个小时内被释放如下,在梗死后的许多天里保持在较高水平。将这些报道的数据综合起来看到,肌钙蛋白-I水平在胸痛出现后4～8小时变得不正常,在12～16小时达到峰值,梗死后持续在较高水平5～9天[4-6]。根据这些研究,肌钙蛋白-I在CKMB和LD的诊断窗口期升高[7]。最新临床研究也提示,存在骨骼肌损伤时,肌钙蛋白-I对探查心肌损伤比CKMB的心脏异性更高[8-9]。

心肌肌钙蛋白I水平测定提供为在广泛的诊断窗口期一种敏感特异性地心肌损伤诊断方法。在急性冠状动脉综合征期,包括Q-波MI、非Q-波MI和不稳定心绞痛,已观察到心肌肌钙蛋白I水平升高。在能够测定出心肌肌钙蛋白I水平的非-Q-波MI和不稳定心绞痛的病人,观察到死亡率极高。提示心肌肌钙蛋白I为这些病人的危险分级提供了一种方法[10]。

2检测方法

2.1非均相免疫法(ELISA法)

非均相免疫法以“夹心”原理为基础的一步法酶免疫检测。样品与包被心肌肌钙蛋白I分子特异性抗体的二氧化铬颗粒和共轭试剂(碱性磷酸酶,ALP)孵育形成颗粒/心肌肌钙蛋白I/共轭物夹心。未结合的共轭物通过磁化分离和冲洗。分离和冲洗后,颗粒/心肌肌钙蛋白I/共轭物夹心被转移到比色杯,在比色杯夹心结合的碱性磷酸酶(ALP)激发和放大级联反应。ALP使合成的黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸(FADP)脱磷酸释放出FAD。FAD与脱辅基d-氨基酸氧化酶结合转化为具有活性的holo d-氨基酸氧化酶。每个holo d-氨基酸氧化酶分子产生多分子过氧化氢分子(H202),在辣根过氧化物酶(HRP)存在的情况下转化为3,5-二氯-2-对氨基苯磺酸(DCHBS)和4-氨基安替比林(4-AAP)形成在510 nm产生光吸收的有色产物[11]。测定的颜色强度与病人样品中的心肌肌钙蛋白I浓度成正比。在Dimension临床生化系统上采用非均相免疫测定模块定量检查人血清的肌钙蛋白I,其检测低限为0.04 ng /mL,检测范围0.04-40 ng /mL,试验的反应时间为5.4分钟。目前该方法已成为检测肌钙蛋白I较成熟的方法。

2.2化学发光法

化学发光法是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术。以该法检测cTnI具有代表性的产品是美国Beckman Coulter 公司的Access 微粒子化学发光免疫分析系统、SIEMENS公司的ADVIA Centaur和ACS-180电化学发光免疫分析系统。Access AccTnI采用了双抗体一步夹心酶免疫分析的方法,以化学发光剂3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酸氧基)苯-1,2-二氧杂环丁氨(AMPPD)为底物,用cTnI单克隆抗体包被的磁性微粒为固相载体,并用ALP标记的cTnI另一单抗作为酶标抗体,检测时,待测抗原与包被在固相载体的抗体及ALP标记的抗体形成夹心复合物,发光剂AMPPD在ALP催化下脱去磷酸根基团而发光。该系统最低检出浓度为0.03 ng/mL,CV<5%, 准确度可达97.8%。

ACS-180电化学发光免疫分析系统则以细小的顺磁性微粒为固相载体,以电化学发光剂吖啶酯标记抗体,待加入氧化剂H202和NaOH后,吖啶酯则可在不需要催化剂的情况下分解、发光,光的强度与待测抗原的浓度成正比。该系统灵敏度接近0.15 ng/mL,回收率为96.97%～102.60%。

ADVIA Centaur化学发光免疫分析系统的超敏TnI检测法是采用直接化学发光技术的3位点夹心免疫测试法。所含的辅助试剂用于减少非特异性结合。二元标记试剂包括一个采用吖啶酯标记的山羊多克隆抗肌钙蛋白I抗体和2个生物素结合的鼠单克隆抗肌钙蛋白I抗体。固相试剂是结合链霉亲和素的乳胶磁颗粒。所有试剂都包含于ReadyPack中。二元标记试剂中的抗体与样品中的肌钙蛋白I结合。免疫复合物中所含的生物素随机与磁性颗粒上标记的链霉亲和素结合。超敏TnI的检测低限为0.006 ng/mL,检测范围0.006-50 ng/mL,回收率为91%～113%。

其干扰实验是根据CLSI文件EP7-A2确定干扰测试[12],将心肌钙蛋白T、骨骼肌钙蛋白I、原肌凝蛋白、肌动蛋白、肌钙蛋白C、轻链肌凝蛋白、肌红蛋白和CK-MB化合物按照规定浓度添加到已知cTnI浓度的样品中。添加样品的ADVIA Centaur超敏TnI检测结果与未添加对照样品进行比较,结果肌动蛋白和肌钙蛋白C<0.005 、骨骼肌钙蛋白I<0.007,其余均未检出有交叉反应,ADVIA Centaur超敏TnI测试项目显示出具有高度的cTnI特异性

2.3免疫比浊法

免疫比浊分析属液相沉淀试验,其基本原理是抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应,形成小分子免疫复合物,在增浊剂的作用下,迅速形成免疫复合物微粒,使反应液出现浊度,待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。该法根据检测器的位置及其所检测的光信号的不同,可分为免疫乳胶比浊法(turbidimetry)、免疫散射比浊法(nephelometry)等。王永卿[13]报道了免疫乳胶比浊法测定cTnI的临床应用。该法将cTnI与胶乳颗粒表面的抗体结合,导致相邻的胶乳颗粒彼此交联,进而通过比较反应前后透射光和散射光改变的程度,达到测定的目的。该法灵敏度可达0.3 ng/mL,线性范围为0～25 ng/mL,批内CV值4.0%,批间CV值4.7%。李宁沙等[14]同样采用了此法检测cTnI,并比较了不同抗凝剂对检测结果的影响,发现肝素锂相对于肝素钠、EDTA-K2而言,对抗原活性影响最小,是较为理想的抗凝剂。上述研究证实免疫比浊法相关性好、线性范围宽、精密度高,具有一定的临床应用价值。

2.4胶体金免疫层析法(ICA)

免疫金技术是继放射性同位素标记、酶标记、发光荧光标记之后的又一大标记技术。胶体金由于具有特殊的光学性质和电性质,例如显色性、导电性和非线性光学特性等,在免疫分析方面有着其独特的优势。目前,金标免疫法主要是应用到与免疫层析技术相结合的ICA中,该法标本用量少,简便快速,适合于cTnI的床旁检测。国外在这方面的研究相对较多,如美国的Spectral Diagnostics 公司、德国莱帮公司等都推出了利用ICA法制备的cTnI检测卡,其基本原理均是利用两个cTnI单克隆抗体的结合来检测cTnI。当血清样本滴到吸收孔内,第一个被胶体金标记的抗体与cTnI结合形成一个抗体抗原结合体。第二个固定化的cTnI单抗捕捉到这个结合体,产生一个粉红色的颜色带,相对于无结合体的存在,反应圈内则没有色带。但基于该方法开发的检测卡,虽可快速完成检测,但仅能用于cTnI定性和急性心肌梗死患者的初选,临床应用有一定局限性。

随着肌钙蛋白I广泛应用于临床诊断,取得了良好的效果,作为检测心肌损伤高度特异与敏感的指标。目前由于其检测方法尚未完全标准化,使不同检测系统的测定结果缺乏可比性。因此,在抗体的制备、参照物和检测试剂等许多方面均需建立统一的标准。随着在这方面研究的进一步深入,以及抗体制备及标记技术的不断进步,cTnI检测会有更广泛的研发及应用前景。

参考文献:

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[11] Obzansky DM, et al.Sensitive, colorimetric enzyme amplification cascade for determination of alkaline phosphatase and application of the method to immunoassay of thyrotropin[J].Clin Chem,1991,37:1513-1518.

[12] Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guideline. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute,2002. NCCLS document EP7-A2.

[13] 王永卿.免疫比浊法测定心肌钙蛋白I的临床应用[J].检验医学与临床,2006,3(1):28- 29.

[14] 李宁沙,王明达.胶乳增强免疫比浊法测量肌钙蛋白的方法学评价和应用[J].医学临床研究,2007,24(7):1186-1187.

(收稿日期2009-10-29)