不同培养基对Beagle犬骨髓基质细胞增殖与分化的影响

黄永玲 闫福华 钟泉 赵欣

·论著·

不同培养基对Beagle犬骨髓基质细胞增殖与分化的影响

黄永玲 闫福华 钟泉 赵欣

目的研究α-MEM、DMEM-LG、RPMI 1640三种培养基对Beagle犬骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）体外培养生物学行为的影响，为BMSCs的培养寻找合适的培养基。方法取6只Beagle犬的BMSCs，分别用α-MEM、DMEM-LG、RPMI 1640三种培养基进行培养，比较3组细胞的贴壁、增殖及矿化等方面的差异。结果α-MEM组24 h内贴壁的细胞数目最多；消除贴壁差异后，α-MEM和DMEM-LG促增殖作用相近；α-MEM组碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）表达量最高，但矿化结节形成数目较少，DMEM-LG组矿化结节形成个数最多。结论DMEM-LG培养基较适合BMSCs的培养。

骨髓基质细胞组织工程培养基增殖分化

BMSCs是成体干细胞之一，具有多向分化潜能，在不同环境和细胞因子作用下，能向骨、软骨、肌肉和神经等中胚层或外胚层组织细胞分化[1-2]。由于骨髓中BMSCs含量极少，建立高效快捷的体外扩增技术已成为BMSCs应用过程中迫切需要解决的问题之一。在体外培养扩增的研究中，培养基是构成细胞体外培养环境的重要因素，通过改善培养环境，可在较短时间内提高扩增倍数，减少扩增过程中的分化与老化[3]。目前常用的培养基有α-MEM、DMEM-LG和RPMI 1640，但不同培养基对种子细胞的增殖与分化作用的报道较少。本实验通过比较这三种培养基对BMSCs生物学行为的影响，为牙周组织工程中种子细胞的培养寻找合适的培养基。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性Beagle犬6只，体重约10 kg（购自四川省医学科学院实验动物研究所），圈养于中国人民解放军南京军区福州总医院比较医学科。

1.2 实验试剂与主要仪器

DMEM-LG培养基（Gibco，美国），RPMI 1640培养基（Gibco，美国），α-MEM培养基（Gibco，美国），新生牛血清（Gibco，美国），胰蛋白酶（Sigma，美国），MTT（Sigma，美国），L－谷氨酰胺（Sigma，美国），ALP检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司），CO2培养箱（Heraeus，德国），FACSCalibur流式细胞仪（BD，美国），荧光倒置相差显微镜（Olympus，日本），酶标仪（Human，德国）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养观察

参照文献[4]的方法，采用全骨髓培养法培养BMSCs。以氯胺酮全麻，从6只Beagle犬股骨近端各抽取骨髓15 mL，在无菌条件下注入含20 mL无血清培养基的离心管中，1 000 rmp离心5 min（2次），弃上清液，均分成3份，置于100 mm培养皿中进行培养。分别加入8 mL含10%新生牛血清的α-MEM、DMEM-LG和RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，2 d时半量换液，5 d时全量换液。以后每隔3 d换液，倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况。待细胞生长融合后，用2.5 g/L胰蛋白酶+1 g/L EDTA消化传代。

1.3.2 贴壁状况

取传代培养的第6代细胞，调整细胞密度至2.5×104cells/mL，每孔200 μL，接种到96孔板中。分别在2 h、7 h、10 h、24 h时以MTT法测定A492。

1.3.3 细胞增殖

1.3.3.1 MTT法检测

取第4代细胞，细胞密度为1.0×104cells/mL，每孔200 μL，接种到96孔板中。采用其中一种培养基接种24 h后，消除贴壁差异，再分别更换不同培养基进行培养。MTT法测定接种后1～7 d的A492，结果取平均值。其余两组检测方法同上。

1.3.3.2 集落形成

取传代培养的第4代细胞，以1.0×105cells/mL接种至100 mm培养皿，分别用DMEM-LG、RPMI 1640、α-MEM培养基进行培养，1周后行结晶紫染色，观察集落形成情况。

1.3.3.3 细胞周期

取3种培养基培养的第3代细胞，调整密度至1.0×106cells/mL，70%乙醇固定，流式细胞仪检测。

1.3.4 矿化能力

1.3.4.1 ALP含量测定

选取第3代细胞，以5.0×104个/孔接种于24孔板，每组6孔，每隔3 d换液，分别在接种后4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d取出。吸弃孔内培养液，PBS漂洗3次，加入50 μL 1%TritonX-100，4℃冰箱过夜，用ALP检测试剂盒进行测定。

1.3.4.2 Von Kosssa染色

选取第3代细胞，以5.0×104个/孔接种于24孔板，每组6孔，每隔3 d换液，连续培养至出现肉眼可见的白色结节，行Von Kosssa染色，在倒置显微镜下观察矿化结节形成情况。

1.4 统计学方法

应用SPSS 13.0进行统计学处理，对ALP活性、贴壁状况检测结果采用单因素方差分析，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 细胞培养观察

接种初始，皿底沉淀有大量血细胞，无法观察到细胞贴壁情况。5 d时全量换液，可见大部分细胞呈梭形，少数呈圆形或多角形，α-MEM组细胞与其他两组相比数量较多（图1）。DMEM-LG和RPMI 1640组培养10～12 d可达90%融合，即可进行消化传代。α-MEM组至7 d时应及时传代，否则易覆层生长并形成膜状物漂浮于培养基中。

2.2 贴壁状况

随着培养时间延长，细胞贴壁数逐渐增多。α-MEM组2 h时，贴壁的细胞数显著高于其余两组（P＜0.05），7 h时细胞已大部分贴壁，而7 h和10 h、24 h间差异无显著性（P＞0.05）。DMEM-LG组和RPMI 1640组24 h时才大部分贴壁，此两组间差异无显著性（P＞0.05）（图2）。

2.3 细胞增殖

2.3.1 MTT法检测

消除贴壁差异后，比较3组细胞增殖情况：α-MEM组和DMEM-LG组细胞生长无显著性差异（P＞0.05），但和RPMI 1640组间有显著性差异(P＜0.05)（图3）。

2.3.2 集落形成情况

结晶紫染色观察集落形成情况，可见RPMI 1640组形成集落个数少且较细小，DMEM-LG组适中，α-MEM组形成的集落个数最多且较粗大（图4）。

2.3.3 细胞周期

α-MEM组、DMEM-LG组、RPMI 1640组中S期细胞分别35.08%、22.70%、6.69%，G1期细胞分别为53.23%、66.08、92.03%（图5）。

2.4 矿化能力检测

2.4.1 ALP含量测定

不同培养基培养的细胞的ALP含量，均随培养时间的延长而增加。α-MEM组ALP含量明显高于其余两组（P＜0.05），在第8天时含量显著增加。DMEM-LG组从第6天开始，ALP含量逐渐高于RPMI 1640组，在第12天和第14天时差异有显著性（P＜0.05）（图6）。

2.4.2 Von Kosssa染色

α-MEM组增殖速度快，自身复层生长，约7 d时形成类似组织团块样结构，只在培养皿边缘存在少量矿化结节。DMEM-LG组约6～7 d有结节形成，RPMI 1640组约10～12 d形成结节。Von Kosssa染色可见：DMEM-LG组形成的结节数目较多且较大，散状分布；RPMI 1640组形成的结节数目较少且较小，大多分布于培养皿边缘（图7）。

图1 原代细胞的增殖状况（100×）

图2 BMSCs在三种不同培养基中的贴壁情况

图3 消除贴壁差异的生长曲线（MTT法）

图4 集落形成情况

图5 细胞周期检测

图6 三种培养基ALP活性测定

图7 Von Kosssa染色（100×）

3 讨论

BMSCs是目前组织工程中主要的种子细胞之一，具有多向分化潜能，但其在体内数量较少，并且BMSCs的成骨能力随着年龄的增加而逐渐减弱[5-7]。因此，如何改善体外培养环境，使BMSCs能在较短时间内迅速扩增，并减少扩增过程中的分化与老化现象以维持干细胞的功能，这一系列问题成为体外培养研究中的重点。

培养基是构成细胞体外培养环境的重要因素，目前BMSCs体外培养大多采用α-MEM、DMEMLG和RPMI 1640培养基。α-MEM含有附加氨基酸、维生素以及核苷酸和脂肪酸等，可广泛应用于各种类型细胞的体外培养。DMEM-LG是Dulbecco改良的Eagle培养基，营养成分丰富，常用于贴壁细胞培养。RPMI 1640培养基最初是针对淋巴细胞设计的，具有成分简单、氨基酸含量较高等特点，能适用于多种细胞的培养[8]。

研究表明，不同培养基对BMSCs[3]、牙髓细胞[9]、牙周韧带细胞[10]、骨膜细胞[11]的增殖、分化作用是不同的。但哪种是BMSCs体外培养的最适培养基，各学者所得出的结论不尽相同。Javazon等[12]培养鼠BMSCs发现，α-MEM中的细胞扩增倍数是DMEM的2倍。Majumdar等[13]研究表明，α-MEM较DMEM-LG更能促进人BMSCs的增殖。然而，Coelho等[14]发现，α-MEM和DMEM-LG对人BMSCs增殖没有显著差异，但α-MEM有助于人BMSCs成骨能力的维持。本实验通过比较α-MEM、DMEM-LG和RPMI 1640三种培养基对BMSCs贴壁、增殖和分化方面的影响，为BMSCs的培养寻找合适的培养基。

贴壁是体外培养BMSCs的主要过程之一，是BMSCs生长的必要条件。本实验发现，α-MEM组24 h贴壁的细胞数明显高于DMEM-LG组和RPMI 1640组，此结果和须珏华等[3]的研究结论一致。研究表明，影响细胞贴壁的主要因素有：血清[15]、贴壁介质表面特性[16]和pH值[17]等。本实验通过比较三种培养基，发现三者之间pH值相差约0.3～0.4。动物细胞大多数需要在轻微的碱性条件下生长，α-MEM与其余两种相比呈偏碱性，因而我们推断三种培养基中不同的pH值影响了BMSCs的贴附。

本研究发现在消除贴壁差异后，α-MEM和DMEM-LG促增殖作用相近，α-MEM略高于DMEM-LG；RPMI 1640促增殖作用明显不如α-MEM和DMEM-LG。有研究发现，培养基中的多种成分能影响细胞的增殖。Lopez等[10]和Maeno等[18]的研究表明，增加一定量的钙浓度可促进成骨细胞增殖。比较三组钙浓度：α-MEM为200 mg/L，DMEMLG为265 mg/L，RPMI 1640无氯化钙成分[9]。此外，有研究表明，糖浓度也是影响细胞增殖的要素之一。比较三种培养基成分发现，RPMI 1640中葡萄糖含量是α-MEM和DMEM-LG的2倍。Stolzing等[19]发现，较低的葡萄糖浓度能减少细胞凋亡，促进细胞增殖。Tennant等[20]认为，高浓度葡萄糖代谢产生较多乳酸，可抑制细胞生长。因此，我们推测培养基中钙和糖浓度均可能影响细胞的增殖，究竟哪种成分作用更强，尚有待进一步的研究。

BMSCs在三种培养基中，均可向成骨方向诱导。本实验结果表明，α-MEM组中ALP含量明显高于其余2组，但矿化结节形成的个数最少；DMEMLG组ALP含量低于α-MEM组，但形成的矿化结节个数最多。Maeno等[18]报道，ALP阳性细胞率与钙浓度的增加成正相关。Lopez等[10]也报道ALP表达与培养基中钙浓度的相对增加有关。本实验单从ALP检测结果上看与其相符，但Von Kosssa染色结果却与其不一致。Goshima等[21]的研究表明，细胞数量过多，容易造成细胞堆积，不利于细胞伸展和成骨潜能的发挥。因而我们推测造成此结果的原因可能是α-MEM组中细胞贴壁率高且增殖速度快，造成细胞基数大，相应分泌的ALP也比较高，但其成骨潜能方面受到了抑制。

综上所述，本实验结果表明，培养基α-MEM促进BMSCs的增殖，但矿化能力方面较弱；DMEM-LG培养基促进细胞增殖和分化，较适合BMSCs的体外培养。

[1]Bianco P,Riminucci M,Gronthos S,et al.Bone marrow stromal stem cells:nature,biology,and potential applications[J].Stem Cells, 2001,19(3):180-192.

[2]杨琴,曾志磊,谢鹏,等.体外培养大鼠骨髓基质细胞生物学特性研究[J].重庆医科大学学报,2007,32(9):926-929.

[3]须珏华,胡静波,周燕,等.培养基对兔骨髓间充质干细胞扩增与分化的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(3):467-470.

[4]闫福华,刘崇武,周广武.骨髓基质细胞在三种可吸收生物膜上附着及增殖的比较[J].福建医科大学学报,2002,36(1):10-13.

[5]Tuli R,Seghatoleslami MR,Tuli S,et al.A simple,high-yield method for obtaining multip-otential mesenchymal progenitor cells from trabecular bone[J].Mol Biotechnol,2003,23(1):37-49.

[6]Zhou S,Greenberger JS,Epperly MW,et al.Age-related intrinsic changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and their differentiation to osteoblasts[J].NIH Public Access Author Manu-script,2008,7(3):335-343.

[7]Kretlow JD,Jin YQ,Liu W,et al.Donor age and cell passag affects differentiation pote-ntial of murine bone marrow-derived stem cells [J].BMC Cell Biol,2008,9:60.

[8]司徒镇强,吴军正.细胞培养[M],第2版.西安:世界图书出版西安公司,2007:43-45.

[9]Lopez-Cazaux S,Bluteau G,Magne D,et al.Culture medium modulates the behaviour of human dental pulp-derived cells:technical note [J].European Cells and Materials,2006,11:35-42.

[10]Hou LT,Li TI,Liu CM,et al.Modulation of osteogenic potential by recombinant human bone morphogenic protein-2 in human periodontal ligament cells:effect of serum,culture medium,and osteoinductive medium[J].J Periodontal Res,2007,42(3):244-252.

[11]Wu X,Lin M,Li Y,et al.Effects of DMEM and RPMI 1640 on the biological behavior of dog periosteum-derived cells[J].Cytotechnology, 2009,59(2):103-111.

[12]Javazon EH,Colter DC,Schwarz EJ,et al.Rat marrow stromal cells are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than human marrow stromal cells[J]. Stem Cells,2001,19(3):219-225.

[13]Majumdar MK,Banks V,Peluso DP,et al.Isolation,characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells[J].J Cell Physiol,2000,185(1):98-106.

[14]Coelho MJ,Cabral AT,Fernande MH.Human bone cell cultures in biocompatibility testing.Part I:osteoblastic differentiation of serially passaged human bone marrow cells cultured in alpha-MEM and in DMEM[J].Biomaterials,2000,21(11):1087-1094.

[15]Ohnishi K.Serum levels of thrombomodulin,intercellular adhesion molecule-1,vascular cell adhesion molecule-1,and E-selectin in the acute phase of Plasmodium vivax malaria[J].Am J Trop Med Hyg,1999,60(2):248-250.

[16]Boateng SY,Lateef SS,Mosley W,et al.RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes [J].Am J Physiol Cell Physiol,2005,288(1):C30-38.

[17]Willett RL,Baldwin KW,West KW,et al.Differential adhesion of amino acids to inorg-anic surfaces[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(22):7817-7822.

[18]Maeno S,Niki Y,Matsumoto H,et al.The effect of calciumion concentration on osteoblast viability,proliferation and differentiation in monolayer and 3D culture[J].Biomaterials,2005,26(23):4847-4855.

[19]StolzingA,ColemanN,ScuttA.Glucose-inducedreplicativesenescence in mesenchymal stem cells[J].Rejuvenation Res,2006,9(1):31-35. [20]Tennant GB,Truran LN,Bailey-Wood R,et al.Control of pH in human long-term bone marrow cultures with low-glucose medium containing zwitterion buffer lengthens the period of haemopoietic activity[J].Br J Haematol,2000,109(4):785-787.

[21]Goshima J,Goldberg VM,Caplan AI.The osteogenic potential of culture-expanded rat marrow mesenchymal cells assayed in vivo in calcium phosphate ceramic blocks[J].Clin Orthop Relat Res,1991, 262:298-311.

Effects of Media on the Proliferation and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells in Beagle Dogs

ObjectiveTo investigate the effects of different media:α-MEM,DMEM-LG and RPMI 1640 on the biological behavior of bone marrow stromal cells(BMSCs)in Beagle dogs,and provide the more ideal culture medium for BMSCs.MethodsBMSCs derived from 6 Beagle dogs were harvested and grown in α-MEM,DMEM-LG and RPMI 1640 media respectively.The proliferation,attachment rate and mineralized nodules of the cells were observed and compared.ResultsCells cultured by α-MEM showed the highest attachment rat.After eliminating the difference of adherent rate,there was no obvious difference in the proliferation between α-MEM and DMEM.In α-MEM group,the expression of alkaline phosphate (ALP)was the highest,while the number of mineralized nodules was the least.DMEM group exhibited the most mineralized nodules.ConclusionAs a culture medium DMEM-LG may be more suitable for BMSCs of dogs in vitro.

Bone marrow stromal cells;Tissue engineering;Media;Proliferation;Differentiation

Q813.1+1

A

1673－0364（2009）04－0181－05

2009年5月27日；

2009年7月1日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.001

国家自然科学基金(30471892)、福建省自然科学基金（2008J0085）、福建医科大学附属口腔医院重点学科建设学术发展基金[闽医大口腔（2008）39号]。

350004福建省福州市福建医科大学口腔医学院，福建医科大学口腔组织工程研究室。

闫福华。

HUANG Yongling,YAN Fuhua,ZHONG Quan,ZHAO Xin.

School of Stomatology,Tissue Engineering Research Center of Stomatology, Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China.Corresponding author:YAN Fuhua.