侵染葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒广西分离物分子鉴定

秦碧霞　蔡健和　刘志明　魏源文　谢　玲　朱桂宁

摘要：从广西南宁市郊温室大棚中的葫芦[Lagenaria siceraria(Molina)stand.]上采集到一个表现脉绿、花叶症状的病毒样品，ELISA检测表明，该样品与黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)有密切的血清学关系，利用RT-PCR方法从样品中扩增获得约500bp的DNA片段，序列分析表明，该片段是CGMMV的外壳蛋白基因，暂将该病毒分离物定名为GX-BG。外壳蛋白基因核苷酸序列系统进化树分析表明，已报道的CGMMV主要分为3大群体，GX-BG与中国辽宁分离物(CGMMV-LN)分别属于不同的群体。

关键词：黄瓜绿斑驳花叶病毒；外壳蛋白基因；序列分析；鉴定

中图分类号：S 436．429

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mo-saic virus，CGMMV)最早在英国的黄瓜上被发现和报道，主要分布在欧洲、印度、日本等地的葫芦科植物上，曾在一些国家和地区造成严重危害。2005年秦碧霞等在中国首次报道CGMMV侵染广西观赏南瓜，本文报道侵染广西葫芦的CGMMV分离物分子鉴定及其外壳蛋白基因序列分析。

1材料和方法

1．1试验材料

表现脉绿、花叶症状的葫芦叶片采自广西南宁市郊温室大棚；西瓜花叶病毒(Watermelon mosaicvirus，WMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellow mosaic virus，ZYMV)和黄瓜花叶病毒(Cu-cumber mosaic virus，CMV)抗血清分别由Dr.Piero Roggero(Istituto Fitovirologia Applicata，CNR，Ita-ly)、浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所和中国农业科学院油料研究所惠赠；南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，SqMV)和CGMMV抗血清购自美国Agdia公司，山羊抗兔IgG-AP、山羊抗小鼠IgG-AP购自华美生物工程公司；Trizol为北京博大泰克生物基因技术有限责任公司产品；Ex Taq聚合酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂(RNasin)、dNTPs等购自宝生物工程(大连)有限公司。

1．2ELISA检测

用抗原直接包被间接ELISA法(DAC-ELISA)检测WMV、ZYMV、CMV、SqMV和CGM-MV。

1．3RT-PCR

1．3．1总RNA的提取

总RNA提取按Trizol试剂使用说明书进行，RNA溶于30 μL DEPC水中备用。

1．3．2RT-PCR

用oligo(dT)为引物，以总RNA为模板，反转录合成cDNA。根据已报道的CGMMV外壳蛋白基因序列设计PCR特异引物，正向引物Pf：5-ATGGCTTACAATCCGATCAC-3，反向引物Pr：5-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGC-3，扩增片段约500 bp。PCR反应体系为20 μL，扩增条件参照陈红运等。用1％琼脂糖电泳检测PCR产物。

1．3．3序列测定及分析

取PCR产物(编号为GX-BG)直接送上海英骏生物技术有限公司克隆测序，序列比较和系统进化树分析采用Vector NTI suite和DNAMAN软件，用于序列分析的外壳蛋白基因分别来自广西分离物(GX-G，DQ647384；GX-BG)、辽宁分离物(LN，DQ217778)、日本分离物(W，AB015146；SH，D12505)、巴基斯坦分离物(PK，AB127937)、印尼分离物(ID，AB194531)、韩国分离物(K-w，AF225984；KW，AF417242；KOM，AF417243；NS，AJ243831；Y，AJ245440)、法国分离物(Fr，AJ429090)、希腊分离物(GR3，AJ459421；GR5，AJ459422；GR7，AJ459423)和印度分离物(BT，AY309021)。

2结果

2．1ELISA检测结果

经DAC-ELISA检测，葫芦病样与CGMMV抗血清呈阳性反应，与WMV、ZYMV、CMV、SqMV抗血清呈阴性反应。

2．2RT-PCR

用CGMMVcP基因引物从葫芦病叶的总RNA中扩增出一条约500 bp的特异性片段，与预期片段大小一致，而健康的葫芦叶片无预期片段出现(图1)。

2．3序列分析

序列分析表明，GX-BG的CP声基因由486个碱基组成，编码161个氨基酸，与已报道的其他CGMMV分离物相同。GX-BG与其他16个分离物的cp基因核苷酸序列同源性均大于90％，与GR5的同源性最低(91.2％)，与LN的同源性达98.1％，与GX-G的cp基因核苷酸序列完全相同。cp声基因核苷酸序列系统进化树分析表明(图2)，这些分离物分为3个主要的进化相关群体，广西分离物(GX-BG和GX-G)与印度(BT)、希腊(GR7)、日本(W)、法国(Fr)、巴基斯坦(PK)的分离物形成一个簇群，其中与W和Fr关系较密切，序列同源性99.4％；辽宁分离物(LN)则与印尼(ID)、日本(SH)、韩国(KW、NS、Y、KOM、K-W)分离物进化成另一簇群，希腊的两个分离物(GR3和GR5)则独立成一簇。

GX-BG与其他16个分离物的cp氨基酸序列同源性均大于98％，其中与GR7、Y的同源性为98.8％，与PK、GR3、GR5的同源性为99.4％，与其余11个分离物的cp氨基酸序列完全相同。

3结论和讨论

ELISA检测和序列分析结果表明，在广西南宁市郊大棚里侵染葫芦引致脉绿和花叶症状的病毒病原是黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)，本研究从分子水平上进一步证实了CGMMV在广西葫芦科作物上的存在。在进化关系上，GX-BG与GX-G、BT、GR7、W、Fr、PK分离物形成一个簇群，与GX-G cp基因核苷酸序列完全一致，与W和Fr关系密切，而与中国辽宁分离物(LN)不属于一个簇群，这可能与各分离物的地域分布及种子来源不同有关。GX-BG与GX-G、LN、W、SH、K-W、KOM、NS、Y、Fr、GR7和BT的cp氨基酸序列完全相同，它们可能有共同的起源。

CGMMV是侵染葫芦科植物的重要病毒之一，对生产影响较大，极易通过汁液摩擦传染，带毒种子、种苗调运是远距离传播的主要方式。2006年我国农业部(农业部公告第788号)已将该病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物，我国台湾、广西、辽宁等地先后报道了该病毒，但目前仅在局部范围发生，各地政府、检疫及植保部门应高度重视，及时采取有效措施，从源头上控制该病毒，避免扩散传播，确保我国葫芦科作物的安全生产。