转基因植物重组ＤＮＡ和表达蛋白的环境分子行为

陈　洋　张永军　吴孔明　彭于发　郭予元

摘要：转基因植物的安全性已经在全球范围内引起了普遍关注。本文从分子水平上就转基因植物的重组DNA在环境中的降解动态、转基因植物重组DNA在生物体内的传递、转基因植物杀虫蛋白在环境中的降解及在食物链间的传递等有关研究进展作一简要介绍。

关键词：转基因植物；重组DNA和蛋白；降解和传递；食物链

中图分类号：Q 78

1引言

转基因作物自1996年在美国商业化种植，已经历了10年的发展，到2006年，全球转基因作物播种面积超过1亿hm²，美国、阿根廷、巴西、加拿大、中国：等国转基因作物的总种植面积超过8 900万hm²。目前已获得的转基因植物主要有棉花、大豆、玉米、烟草、番茄、马铃薯等。与此同时，转基因植物的安全性已经在全球范围内引起了普遍关注，尤其是转基因植物重组DNA和表达蛋白的环境分子行为成为国际研究热点之一。转基因植物的重组DNA可以作为自由的DNA在环境中活动通过植物的根部和花粉进行扩散，在土壤中残留而对一些微生物造成影响，还可以经过水平和垂直传播，渗透到农田周围的地下水和其他水体中，而对一些细菌等微生物具有潜在影响。重组蛋白在转基因植株的整个生育期都有表达，使取食而存活下来的靶标及非靶标昆虫体内的组织器官会不同程度的含有转基因蛋白，当天敌取食这些靶标和非靶标昆虫时，这些重组蛋白就有可能传递到其天敌的体内，直接或间接通过食物链(网)对天敌的数量和质量产生影响。重组蛋白还可以通过根系的分泌或者植株残体的降解进入土壤中，有可能对土壤生物系统产生影响。

2转基因植物重组DNA的降解动态

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增，在扩增反应结束之后，通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析。Widmer等人最先用PCR手段对田间土壤中残留的植物基因组DNA进行了定量分析。随后，Alvarez等采用PcR技术对与黏土矿物结合的DNA进行了扩增。Lutz等利用PCR技术把非重组基因rubisco(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶基因)与重组crylAb基因在转基因玉米青贮时期的降解进行了比较。根据两种基因的全长，对rubisco基因设计了5对引物，相对应的片断大小分别为：173、896、1 197、1 753和2 521 bp；对crylAb基因设计了4对引物，相对应的片断大小分别为：211、420、727 bp和1 423 bp。rubisco基因的173 bp片断在玉米残体内61 d后仍然可以检测到，到第30天为止，还可以检测到1 197 bp的片断，但是2 521 bp的片段只有在第1天出现。另外，直到第61天还可以检测到211和420 bp的crylAb基因片段，727 bp片断在第30天内可以检测到，而1 423 bp的片段在前6天可内检测到。因此认为crylAb基因的降解过程与非重组基因rubisco的降解过程是相似的。

无论定性还是定量分析，分析的都是PCR的终产物。但是在许多情况下，所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。实时定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在DNA量比较少的情况下，可以应用实时定量PCR方法对重组DNA进行检测。一些转基因植物具有抗生素基因作为选择标记，这些抗生素基因尽管经过生命体和非生命体的降解，例如：微生物的、物理的、化学的降解，但是这些细胞外DNA仍可以作为自由的DNA在环境中活动，并且可能被一些水中的细菌所利用，使得它们获得抗性，因此可能对环境和人类健康存在潜在的危害。Zhu用一种高灵敏度的sYBR Green Ⅰ作为荧光染料的实时定量PCR方法对转Bt基因玉米(MON863)中的nptⅡ(新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因)进行了定量分析，并且监测了两种地下水和河流水中npt Ⅱ基因降解的动态。实时定量PCR试验表明，两种地下水和河流水中的DNA扩增模式相似；3种水质高压灭菌处理后的Ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)没有改变，表明了高压灭菌处理中的DNA的稳定性。在3种水质的未被处理和过滤除菌处理中，在48～96 h内DNA的含量从0。8 mg／mL降到0.008 mg／mL，与此相反，高压灭菌的水中DNA的含量没有改变。因此认为不同的水质和环境条件可能是影响DNA降解速度的因素，而较低的温度是影响微生物和酶的活性进而导致DNA降解减慢的原因之一。Douville等人也利用实时定量PCR技术对转基因玉米地周围的不同环境中crylAb基因的存在和残留进行了研究，发现crylAb基因在表面水和沉淀物中分别可以保持21 d和40 d，即使是过滤除菌的表面水中的crylAb基因的半衰期也没有明显增长。在黏沙土沉淀物中40 d以后可以检测到来源于Bt玉米的crylAb基因，在距离玉米地下游的82 km处的水中仍然可以检测到crylAb基因。Gebhard等选取了3对特异性引物来扩增转基因重组DNA，在田间情况下，几个月后也可以检测到转基因甜菜DNA组中的769bp npt Ⅱ基因。

3转基因植物的重组DNA在生物体内的传递和降解

有些学者认为转基因烟草完整的重组DNA经过自然转化有可能进入细菌的基因组中。Rossi等人研究了来源于转基因玉米饲料中的crylAb基因在小鸡消化道中的降解。Zein基因是具有高拷贝数的玉米基因，作为玉米的内标准基因。crylAb基因是插入到玉米系MON 810中的修饰后的单拷贝Bt抗虫基因。作者选取了1 800 bp的片段长度作为一个最小化的功能单位，能够编码整个Bt毒素蛋白。通过监测crylAb转基因可以来检测转基因玉米的重组DNA。另外，Sh-2基因是鸡卵黄原蛋白基因，也是玉米的一种单拷贝基因，与crylAb大小相似，可以作为对照。作者比较了转基因植物的DNA降解是否表现出与非转基因植物的DNA降解不同。研究发现，可以在鸡所有的胃肠部分监测到Zein基因片断，并且在取食转基因和非转基因玉米饲料的鸡中检测到的Zein基因没有差异。在空肠、盲肠和血液中都不能扩增到1 800 bp的crylAb基因和Sh-2基因，并且超过500 bp的DNA片断未在肠的末端区域检出。转基因和非转基因植物处理中的DNA检出频率没有显著区别，这表明基因修饰没有对DNA降解过程产生显著影响。因此，Rossi认为来源于转基因植物饲料中的DNA与来源于常规植物饲料中的DNA最终在环境中的归宿是一样的。

4转基因植物杀虫蛋白在环境中的降解

转基因植物的根系分泌物中有可能含有重组蛋白，同时收获后的转基因植物的残体进入到土壤生态系统，可能对土壤微生物系统造成影响。已有研究表明，在转基因玉米、水稻和马铃薯的根系分泌物中检测到cry基因编码的杀虫蛋白，但是转基因棉花和烟草的根系分泌物中未检测到杀虫蛋白。Hopkins等研究表明，在实验室条件下，向土壤中加入的转Bt基因玉米和非转基因玉米残渣的分解没有明显的差别，并且已分解的植物组织和土壤混合物中的Bt杀虫蛋白在实验室孵育的过程中迅速降解，在14 d以后低于检测极限。Baumgarte等在田间对转基因玉米(MON810)根系物及土壤进行抽样，采用ELISA方法测定了其中crylAb蛋白的含量。在土壤中的CrylAb蛋白含量要比根系物中的含量(1 g土壤中的含量为0.1～10 ng)要低，并且在收获后的土壤中翌年4月份后仍然可以检出CrylAb蛋白，含量是0.21 ng／g，而此时叶片残体中的蛋白含量高达21 ng／g，根残体的含量更高一些达到183 ng／g，根残体中的蛋白含量仅为完整根部的12％。随后过2个月以后抽样发现，蛋白进一步迅速降解。

Zwahlen等同样用ELISA方法研究了瑞士种植区的两块田地的转Bt基因玉米叶片的crylab毒蛋白在秋季、冬季和次年春季的降解情况。第1个处理中植物材料切割成大片装进有大网眼的垃圾袋中然后埋在土壤中，模仿耕作系统中的土壤内玉米残渣。在第1个月里没有发现crylAb毒蛋白降解。在第2个月中，crylAb毒蛋白的浓度卜降到原始浓度的20％，在冬季没有进一步的降解。次年春天气温上升后，毒蛋白继续缓慢降解，直到次年6月仍然可以检测到毒蛋白。第2个处理模拟在免耕系统中的降解，把植物材料直接放在土壤的表面，crylAb毒蛋白浓度在40 d内降低到初始浓度的38％。毒蛋白在试验结束的200 d后持续降解。直到翌年6月份，CrylAb毒蛋白的量只有最初的0.3％。Lutz等人采用ELISA方法研究了青贮玉米饲料中的crylAb蛋白降解动态，研究发现，在43 h之内crylAb蛋白没有显著的降解，在此后的20 d和60 dCrylAb蛋白有显著的降低。同时用免疫印迹方法研究发现，在储存期的前两天内60 kD大小的有活性的CrylAb蛋白存在，且信号很强，在第8天仍然可以检测到微弱阳性信号，但是在12 d以后没有发现有活性的CrylAb蛋白。

Abmad对土壤和蚯蚓的肠道和排泄物中的cry3Abl蛋白进行了检测，在罐子中的土壤和接触Bt玉米根部的蚯蚓的肠道和排泄物都检测到了Cry3Abl蛋白，在12 d和33 d上述蛋白含量没有显著差异。而另一项研究发现在美国Manhat～tan(曼哈顿岛)附近，连续种植转基因玉米最初的1年和以后的3年里，利用ELISA方法检测不到任何一个从Bt玉米混合田及非Bt玉米田土壤样本中的cry3Abl蛋白。但是，在美国的scandia(斯堪的亚)附近种植转基因玉米的第1年的土壤中检测到少量的Cry3Abl蛋白，含量为干重3.38～6.89 ng／g。这些发现表明从根部分泌的或者腐烂的植株残体的cry3Ab1很快就会在土壤中降解，残留时间很短。

5转基因植物杀虫蛋白食物链间的传递

重组蛋白在植物的整个生育期得到持续表达，在对靶标昆虫起到良好控制作用的同时，也对一些非靶标害虫产生了影响。对取食转基因玉米的禾蓟马(Frankliniella tenuicornis Uzel)不同时期体内的crylAb毒素进行定量分析，并对毒素在成虫体内的残留时间进行研究，数据表明在禾蓟马的幼虫和成虫体内Bt毒素的含量最高，在不进食的预蛹期和蛹期没有检测到Bt毒素的存在。在成虫体内Bt毒素的残留时间很短，在24 h之内，CrylAb毒素含量减少了97％量，8 d之后检测不到Bt毒素的存在。Howald等人研究了转基因油菜对非靶标食草虫黄翅菜叶蜂[Athalia rosae(Linnaeus)]的影响。测定了Bt油菜叶片、取食Bt油菜的黄翅菜叶蜂的排泄物、各龄期幼虫、蛹和成虫中CrylAc蛋白的含量。在幼虫体内和粪便内检测到的CrylAc蛋白的含量要比在叶片中的含量少。在幼虫、蛹和成虫体内都检测不到crylAc蛋白。因此认为crylAc蛋白不会对黄翅菜叶蜂本身产生影响，由于在它消化和排泄后依然可以检测到蛋白的存在，因此有可能对其他生物体间接造成影响。weber等人的研究也表明，尽管马陆排泄掉了大多数的Bt蛋白，Bt蛋白不会对它造成影响，但是它的排泄物中的Bt蛋白仍然有活性，这就有可能对其他的土壤生物造成影响。

靶标或非靶标害虫的体内都会不同程度地含有重组蛋白，直接或间接地对捕食性天敌和寄生性天敌产生影响[。已有很多报道转基因作物对捕食者幼虫的发育历期及死亡率，蛹重及成虫存活时期的影响。Duttin等人也对转基因玉米上的3种草食性昆虫体内的毒蛋白进行了测定。在二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)中检测到CrylAb毒素的含量最高，为2.5 μg／g，其次是棉贪夜蛾[Spodo ptera littoralis(Boisduval)]，为0.72 μg／g，在禾谷缢管蚜[Rhopalosi phum padi(Linnaeus)]中只能检测到很痕量的毒素。当给普通草蛉[Chryso perla carnea(Stephen)]饲以上述3种草食性昆虫后，取食二斑叶螨和禾谷缢管蚜的普通草蛉的死亡率、发育历期和体重没有受到影响。相反，当给普通草蛉喂了棉贪夜蛾后，表现出了明显的死亡率上升和发育延迟。二斑叶螨和棉贪夜蛾虽然体内都含有Bt毒素，但是对普通草蛉的影响却不相同，可能是因为普通草蛉对棉贪夜蛾的捕食量少和Bt毒素的交互作用共同导致了普通草蛉取食了棉贪夜蛾后所产生的消极效应。

Torres等人对转基因棉花一害虫一捕食者3级食物链进行了研究，选取了4种草食性昆虫、7种捕食性天敌，在甜菜夜蛾幼虫体内检测到的crylAc蛋白只有14％传递到了捕食性斑腹刺益蝽[Podisusmaculiventris(say)]体内，这就表明crylAc蛋白可以在3级营养阶层间传递。

为了验证捕食者是否直接受Bt毒素的影响，Jorge等人检测了田间代表3个营养级的材料，即：转基因棉花DPL 458RR(转crylAc基因棉花)，取食转基因棉花的甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hnbner)]，及其杂食捕食性天敌大眼长蝽[Geoco-ris punctipes(Say)]中crylAb蛋白的含量。取食转基因棉花叶片的甜菜夜蛾幼虫体内含有Bt毒素，这样Bt毒素通过甜菜夜蛾幼虫，使大眼长蝽幼虫和成虫分别有机会接触到叶片中原始含量的81％和76％的毒蛋白，但是在大眼长蝽成虫体内没有检测到CrylAc蛋白。也有研究表明在一些捕食性天敌的体内可以检测到CrylAc毒蛋白的存在。

couty等人报道GNA可以通过营养阶层传递，GNA对寄生蜂[Aphidius ervi(Haliday)]的影响是和GNA的浓度有关。寄生蜂的幼虫可以排泄出大部分已经消化的GNA，但是可以在蛹中检测到一小部分的GNA。

室内对转基因水稻KMD1中的CrylAb毒蛋白经食物链在几种主要害虫及其捕食性天敌体内的积累进行了研究，表明二化螟[Chilo suppressalis(walker)]和稻眼蝶(Mycalesis gotama Moore)幼虫体内的crylAb蛋白含量均随取食时间延长逐渐下降，二化螟和稻眼蝶幼虫的粪便中均检测到较高浓度的CrylAb蛋白，二化螟幼虫血淋巴中检测到CrylAb蛋白。褐飞虱(Nila parvata lugens Stal)、麦长管蚜(Macrosiphum miscanthi)以及饲喂取食过KMDl的二化螟或稻眼蝶幼虫的拟水狼蛛[Pi-rata subparaticus(Boes.et Str.)]体内都含有一定浓度的CrylAb，这就表明crylAb蛋白可以沿着水稻－害虫－天敌食物链传递。

转基因植物的花粉或花蜜中也不同程度的含有重组蛋白，这就有可能对一些传粉昆虫或重要的经济昆虫造成影响。因为ELISA方法存在检测下限，所以认为在饲喂转基因玉米花粉的蜜蜂成虫的下咽腺中未检测到CrylAb蛋白，转crylAb基因玉米花粉饲喂异色瓢虫[Harmonia axyridis(Pal-las)]后，在瓢虫体内也未检测到Bt杀虫蛋白，转crylA6玉米花粉对异色瓢虫生长发育没有显著负面影响，初步证明Bt玉米MON810花粉对异色瓢虫是安全的。也有研究报道取食转crylAc基因棉花花粉的意大利蜜蜂(Apis mellifera Linnaeus)6日龄幼虫体内能够检测到Bt杀虫蛋白。