改造病毒基因组增强病毒杀虫剂杀虫效率研究进展

蒋　洪　周　亮　张珈敏　胡远扬

摘要：由于基因工程技术的发展和安全性研究的深入，以重组杆状病毒为主的重组昆虫病毒杀虫剂的应用正面临着突破。文章综述了通过修饰或删除昆虫病毒某些基因、插入控制宿主发育、代谢激素或酶的基因、删除、修饰昆虫病毒基因组中特定的基因以扩大宿主域、应用RNA干扰技术提高昆虫病毒杀虫效率等构建重组昆虫病毒杀虫剂的技术路线，展望重组病毒杀虫剂的发展趋势。

关键词：重组病毒杀虫剂；杆状病毒；生物防治；杀虫效率

中图分类号：S 476．13

昆虫病毒是以昆虫为宿主，并可以在其种群中引发流行病的一类病毒。与大量使用的传统化学杀虫剂相比，以昆虫病毒为有效成分的病毒杀虫剂具有以下特点：防治效率高，不仅使用剂量极低，而且可以达到持续控制的效果；对人、畜、非靶标动物安全，保护天敌；极大减少了环境、食物的化学品残留；增加了应用环境的生物多样性；剂型便于储运，有较长的货架寿命；适合常规施药方法，与害虫综合防治系统相容性好，正显示日益强大的生命力。

但是，野生性的昆虫病毒用作杀虫剂也存在很多限制。与化学杀虫剂相比，病毒杀虫剂杀虫速度慢，在害虫被控制以前，可能已经造成了较大的损失。病毒杀虫剂还有对紫外线敏感，需要活体增殖等缺点。另外，病毒对宿主的专一性导致的杀虫谱狭窄也限制了其作为生物防治因子的广泛应用。

为提高昆虫病毒对宿主的杀虫效率，应用现代分子生物学技术，可以通过昆虫病毒基因组的基因工程提高病毒杀虫剂的杀虫效率、拓宽杀虫谱。前文“应用昆虫毒素基因构建重组病毒杀虫剂研究进展”总结了插入昆虫病毒基因组以构建重组病毒杀虫剂的技术路线，现将应用调控昆虫代谢、发育的基因、某些酶基因等外源基因重组昆虫病毒提升控制宿主的效率、或通过删除、修饰昆虫病毒基因组内的某些基因增强病毒的杀虫效率、扩大病毒的宿主域的研究进展进行综述，全面反映重组病毒杀虫剂的研究进展。

1修饰或删除昆虫病毒某些基因构建重组昆虫病毒

寄生于宿主细胞内的昆虫病毒，为了完成其生命活动和维持种群的增长，在与宿主长期的协同进化过程中，获得了一些对宿主生理调控的功能，以使宿主生命维持相对长的时间，有利于昆虫病毒在宿主细胞内完成增殖过程。例如AcMNPV基因组中的p35和iap基因可以抑制病毒感染引发的宿主细胞凋亡过程，关闭宿主细胞抗病毒机制。AcMNPV基因组中UDP葡萄糖基转移酶基因(ecdysterioid UDP-giucoferase gene，egt)编码蜕皮激素是一个重要的杆状病毒调控基因。它可以通过把葡萄糖、半乳糖与蜕皮甾类激素偶联而使后者失活，抑制宿主蜕皮和化蛹，以利于病毒在幼虫体内增殖。研究表明，将egt基因失活构建的重组AcMNNPV可以使草地夜蛾(Spodoptera fru-giperda)幼虫的死亡速度比野生型缩短30％，同时感染的幼虫取食量显著减少。插入外源片段使egt基因失活构建的重组AgMNPV感染大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)3龄幼虫，与野生型AgM-NPV相比，半数死亡浓度LC₅₀降低3.9倍，死亡时间也显著提前。

缺失egt基因的重组杆状病毒的作用效果与幼虫的龄期有关，主要影响5龄幼虫的存活时间和取食量，可以使危害最大的5龄幼虫半数死亡时间(LT₅₀)缩短33％，半数停止摄食时间(FT₅₀)缩短32％。在病毒基因组编码egt的阅读框ORF中插入昆虫特异性毒素基因构建重组杆状病毒，在失活egt基因的同时表达外源昆虫毒素基因可以达到双重增效目的。如插入螨虫的tox34基因并使美洲棉铃虫核型多角体病毒(HzNPV)的egt基因失活所构建的重组HzNPV，感染美洲棉铃虫(He-liothis.zea)结果显示，ET₅₀缩短到40h以内，只有野生型的40％。

昆虫感染杆状病毒的后期症状为虫体发生液化，这是由于病毒编码的几丁质酶和组织蛋白酶表达后起的作用。杆状病毒几丁质酶基因C末端有一个编码细胞内质网定位信号的KDEL阅读框，其功能是使活化后的几丁质酶定位于宿主细胞的内质网上。删除KDEL阅读框构建的重组病毒AcM-NPV感染昆虫细胞后，几丁质酶散布于细胞质内，并可以分泌出细胞外的培养基中。试验结果发现，与野生型AcMNPV比较，基因组中删除KDEL阅读框的重组AcMNPV病毒感染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的半数死亡时间LT₅₀从69 h缩短到61 h，半数致死剂量(LD₅₀)和对作物的损失都显著降低。

2插入控制宿主发育、代谢激素或酶的基因构建重组昆虫病毒

保幼激素(juvenile hormone，JH)是调控昆虫体内组织分化的激素，起着保持幼虫状态，推迟化蛹的功能。保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase，JHE)则切割JH的甲基酯，使其失活。利用重组昆虫病毒在宿主体内过量表达JHE，降低JH滴度，加速幼虫的早熟和化蛹是构建重组杆状病毒的另一条途径。研究显示，将在不同位置突变修饰的2个JH基因插入AcMNPV的p10启动子下游构建重组病毒AcJHE-KK和AcJHE-sG，测试结果均表现出良好的杀虫效果。与野生型相比，可以降低烟芽夜蛾(Heliothis virescens)对莴苣损失的66％和50％。

鳞翅目昆虫组织的周围由基底膜包围，起着阻挡病原体侵入和病毒感染扩散的功能。在杆状病毒基因组中插入相关的蛋白酶基因，在宿主体内表达后，可以酶解宿主昆虫组织的基底膜，从而提高杆状病毒的持续感染效果。试验证实，将来源于蝇类的蛋白酶基因ScathL(组织蛋白酶L，属于半胱氨酸蛋白酶)插入在AcMNPV的p6.9启动子下游构建重组AcMNPV，与野生型相比，可以缩短烟芽夜蛾(H.virescens)存活时间50％，并且比在同样位置插入蝎LqIT2毒素基因构建的重组病毒缩短30％。进一步研究显示，该插入蛋白酶基因的重组AcMNPV摄食莴苣的量只有野生型的1／26。但是进一步研究发现，表达有效的或失活的ScathL基因并没有对重组的AcMNPV病毒粒子在烟芽夜蛾幼虫体内分布或定向扩散有明显影响，基底膜能否作为昆虫病毒在幼虫体内扩散的阻挡屏障有待进一步研究。

3删除、修饰病毒基因组中特定的基因以扩大宿主域。拓宽杀虫谱

昆虫病毒对宿主的专一性决定了其只能感染特定的一种或几种宿主，限制了推广应用。采用基因工程手段，通过改造杆状病毒基因组，可以扩大其宿主域，从而拓宽病毒杀虫剂的应用。

昆虫病毒进入细胞的方式比较特殊，一般不需

要特异性的受体，或者与其结合的受体在动物细胞膜上广泛存在，例如AcMNPV可以进入某些非允许的昆虫和哺乳动物细胞。研究显示，昆虫病毒对宿主的专一性主要取决于病毒基因组在宿主细胞内的复制和晚期基因的表达，昆虫体内的免疫系统也有作用心。

目前已知影响杆状病毒宿主的基因有p143，p35，hrf-1等，重组此类基因有可能扩展宿主域。p143是杆状病毒基因组中编码解旋酶的基因，将AcMNPV的p143置换成BmNPV的p143构建重组AcMNPV，试验证明，该重组AcMNPV的宿主域扩展到家蚕细胞系和幼虫。插入舞毒蛾核型多角体病毒(LdNPV)的hrf-1基因构建重组AcMNPV，试验结果显示该重组病毒可以经口感染舞毒蛾(gypsy moth)，但是不能产生持续性的感染，可能是由于昆虫细胞膜对非特异病毒的扩散有阻挡作用。

4应用RNA干扰技术提高昆虫病毒杀虫效率

利用杆状病毒载体在宿主体内转录一段特定的RNA序列，该序列与宿主某个关键的基因转录产物(mRNA)互补，宿主这个在生长、发育过程中起重要作用的mRNA与载体转录的RNA互补后，失去翻译功能，从而使该基因沉默。该技术路线直接作用于靶基因的转录环节，具有安全性好、作用时间提前等特点，是比较新的一条技术路线。

c-myc是广泛存在脊椎动物和某些无脊椎动物体内的一个重要基因，其编码的磷酸化核蛋白具有调控细胞分裂、休眠、分化、死亡等多种作用。将该基因中一段保守序列的互补DNA序列插入Ac-MNPV多角体启动子下游构建重组病毒，感染草地贪夜蛾幼虫。试验显示，感染3 d后，处理组75％的宿主幼虫停止摄食，野生型AcMNPV同时间只有25％的幼虫停止摄食，感染3 d通常是多角体启动子开始表达的时间。处理组幼虫停止摄食后，2 d内陆续死亡，比对照的野生型病毒感染组死亡时间提前1 d多。结果证实，利用RNA干扰技术可以显著缩短宿主昆虫停止摄食时间，并且幼虫的虫龄越小，效果越显著。

5结语

病毒杀虫剂规模化生产目前都以虫体增殖的方式进行，具有投资少、生产工艺简单、成本适中等优点。重组病毒由于表达了外源基因，增殖时宿主表现出进食少、发育缓慢、虫体小、死亡快等症状，因而影响重组病毒的收获。虽然重组病毒可以大大提高病毒杀虫剂的控制效率，在其大规模应用之前，还必须解决生产的难题，达到商品化生产的要求。

随着昆虫病毒分子生物学研究的深入，可以预见将有更广泛的昆虫病毒通过基因工程提高其防治害虫的应用潜力并被批准大田释放研究，为农林害虫和城市害虫防治提供环境友好的生物防治技术。