脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体的构建

摘要：为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列，设计VP2 2A基因特异性引物，PCR扩增VP2 2A基因目的片段，双酶切目的基因和pcDNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端，使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端，连接产物转化至DH5α感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性单克隆菌落，对阳性单克隆提取重组质粒并双酶切进行验证，对阳性重组质粒进行测序。重组质粒双酶切和测序结果表明，pcDNA3.1-Flag-VP2和pcDNA3.1-Flag-2A真核表达载体构建成功。

关键词：脑心肌炎病毒；VP2基因；2A基因；真核表达载体

脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus， EMCV）是一种重要的人畜共患病病原，主要感染啮齿类、猪及灵长类动物，猪感染后可造成突然死亡和实质器官的广泛病理损伤，引起心肌炎、脑炎、神经系统疾病、生殖系统疾病和糖尿病等，威胁养殖业发展和公共卫生安全。EMCV是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，心肌病毒属[1]。EMCV基因组全长约7.8 kb，包括5′UTR、3′UTR和一个编码区，编码区可编码一种多聚蛋白（L-1ABCD-2ABC-3ABCD），该聚蛋白在3种蛋白酶的作用下被分解成前导蛋白L和前体P1、P2、P3[2-3]。病毒粒子无囊膜，直径约为27nm，粒子表面由衣壳粒子组成，每个衣壳粒子含有4种结构蛋白，即VP1、VP2、VP3和VP4，非结构蛋白则包括2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D等[4-5]。其中VP1、VP2和VP3位于病毒粒子的表面，VP1是最重要的中和性抗原表位，具有最强的免疫原性；VP4位于衣壳内部，抗原性较弱；3C、3D蛋白具有蛋白酶作用；2A蛋白参与自动催化和病毒多聚蛋白的早期裂解[6]。本研究对脑心肌炎病毒的VP2基因和2A基因的真核表达载体进行构建，为后续相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

第一，质粒与毒株。

pcDNA3.1-Flag质粒、EMCV毒株（GenBank登录号X74312），均由西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室提供。

第二，主要试剂。

反转录预混型试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司、DNA Marker购自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司、Trizol试剂、Ex Taq酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自宝日医生物技术（北京）有限公司、琼脂糖凝胶纯化试剂盒、DH5α感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司、质粒提取试剂盒购自北京云肽生物科技有限公司。

第三，主要仪器。

PCR仪[型号：TOne 96G，Biometra]、电泳仪（型号：DYY-6D，

北京六一生物科技有限公司）、凝胶成像仪（型号：Amersham Imager 600，Cytiva思拓凡）

1.2 实验方法

第一，引物设计。

参照EMCV病毒蛋白VP2 2A基因的全长序列（GenBank登录号X74312），使用Primer Premier 5.0软件设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如表1所示。

第二，VP2 2A基因的PCR扩增与纯化。

利用Trizol试剂提取EMCV毒株感染细胞的总RNA，反转录预混型试剂盒反转录为cDNA，具体步骤参照试剂盒说明书。用1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化。

第三，VP2 2A基因真核表达载体的构建与鉴定。

经纯化的VP2基因和pcDNA3.1-Flag质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，2A基因和pcDNA3.1-Flag质粒分别用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切。琼脂糖凝胶电泳检验pcDNA3.1-Flag质粒被酶切为线性化质粒，琼脂糖凝胶回收试剂盒将目的片段与线性化质粒进行纯化。pcDNA3.1-Flag线性化质粒与目的片段用T4 DNA连接酶以1∶3比例连接。连接产物取5μL转化至DH5α感受态细胞中，取100μL转化后菌液均匀涂布于带有氨苄抗性的LB琼脂平板。挑取LB琼脂平板上的单克隆菌落接种于LB液体培养基。取2μL菌液进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定菌液PCR产物中是否存在目的条带。参照质粒提取试剂盒说明书提取阳性菌液质粒并双酶切验证，阳性重组质粒送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 pcDNA3.1-Flag-VP2、pcDNA3.1-Flag-2A真核表达载体构建

第一，VP2 2A基因PCR克隆及pcDNA3.1-Flag载体线性化分析。

EMCV感染HEK293T细胞9hpi，使用RNAiso Plus裂解液裂解细胞，提取RNA，取1μgRNA按照AG反转录试剂盒获得cDNA，以cDNA为模板扩增出VP2 2A基因片段，使用胶回收试剂盒对扩增产物进行纯化，纯化后进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图1A所示，琼脂糖凝胶电泳图中呈现VP2 2A基因扩增长度为767bp和470bp，与NCBI中记录的大小一致，与预期相符，结果表明PCR扩增成功。

对扩增的VP2 2A基因和pcDNA3.1-Flag空载质粒用限制性内切酶进行双酶切验证，使用胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化，琼脂糖凝胶电泳检测其纯化质量。结果如图1B和C所示，VP2 2A酶切后条带大小无变化，pcDNA3.1-Flag质粒被酶切成线性化质粒。

图 1 A： EMCV VP2 2A基因PCR扩增结果 B C： VP2 2A基因和pcDNA3.1-Flag质粒双酶切结果

第二，扩增产物与线性化载体连接转化及重组质粒鉴定。

使用T4 DNA连接酶将PCR纯化产物与pcDNA3.1-Flag线性化载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取克隆质粒验证，对转化成功的重组质粒菌液进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2A所示，重组质粒扩增出VP2和2A基因。结果表明VP2和2A基因与pcDNA3.1-Flag质粒成功连接。

挑选阳性菌液PCR扩增成功的重组质粒进行双酶切验证，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图2B所示，pcDNA3.1-Flag-VP2重组质粒双酶切后存在2个条带，分别是pcDNA3.1-Flag质粒条带和VP2基因条带；pcDNA3.1-Flag-2A重组质粒双酶切后同样存在2个条带，分别是pcDNA3.1-Flag质粒条带和2A基因条带。结果表明pcDNA3.1-Flag真核表达载体构建成功。

2.2 序列比对

将构建成功的pcDNA3.1-Flag-VP2和pcDNA3.1-Flag-2A真核表达载体送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。序列比对结果如图3所示，NCBI提供EMCV毒株X74312序列与pcDNA3.1-Flag-VP2、pcDNA3.1-Flag-2A测序结果比对无缺失或替换，以上结果表明pcDNA3.1-Flag-VP2和pcDNA3.1-Flag-2A真核表达载体构建成功。

3 结论

分别成功构建脑心肌炎病毒VP2、2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-Flag-VP2和pcDNA3.1-Flag-2A，为下一步研究脑心肌炎病毒编码的结构蛋白与非结构蛋白奠定基础。

4 讨论

EMCV在全球范围内分布，被感染动物可出现脑炎或心肌炎等临床症状。VP2蛋白与病毒表面的抗原表位形成相关，具有良好的免疫原性，能够诱导产生特异性抗体和细胞因子的变化；2A参与病毒多聚蛋白的早期裂解。本文成功构建VP2基因和2A基因的真核表达载体为后续脑心肌炎病毒蛋白的表达及功能验证研究提供更多数据支持。■

参考文献：

[1] A Z， B N-S， J P K， H J E. The complete nucleotide sequence and construction of an infectious cDNA clone of a highly virulent encephalomyocarditis virus[J]. Virology， 1994， 203（2）.

[2] Palmenberg A， Kirby E， Janda M， Drake N， Duke G， Potratz K， Collett M. The nucleotide and deduced amino acid sequences of the encephalomyocarditis viral polyprotein coding region[J]. Nucleic acids research， 1984， 12（6）： 2969-2985.

[3] 施开创， 屈素洁， 陈进喜， 许瑞胜， 郑敏， 刘棋， 陈汉忠， 李刚. 猪源脑心肌炎病毒GXLC株全基因组序列测定与分析[J]. 病毒学报， 2010， 26（02）： 134-142.

[4] Kristin M B， Bert L S. Regulation of picornavirus gene expression[J]. Microbes Infect， 2004， 6（7）.

[5] Margot C， Labib B-K. The encephalomyocarditis virus[J]. Virulence， 2012， 3（4）.

[6] Zheng W， Haolin Y， Wenyue Z， Jingxuan C， Yi J， Zhicheng G， Xiaotian H， Qiong L. Cell pyroptosis in picornavirus and its potential for treating viral infection[J]. J Med Virol， 2022， 94（8）.

收稿日期：2024-12-20

基金项目：西北民族大学中央高校基本科研业务费（31920230154）；西北民族大学中央高校基本科研业务费（131920230001）；甘肃省自然科学基金（23JRRA720）

作者简介：邵帅（1998—），女，硕士研究生。研究方向：分子病原学与免疫学。

通讯作者：李琼毅（1980—），女，博士，教授。研究方向：分子病原生物学。