壳聚糖接枝庆大霉素缀合物的毒理安全性评价

摘要：对壳聚糖—庆大霉素缀合物（CS-GT）毒理学安全性评价并研究其在动物机体内的毒物代谢动力效果。通过亚急性经口毒性试验以及CS-GT在小鼠体内吸收及组织分布试验评价CS-GT的毒理安全性。在亚急性经口毒性试验中发现大鼠生理机能正常，各剂量组均未见不可逆性毒性损伤。CS-GT在组织中的分布主要集中于肾、小肠中，6～7.5 h间基本可以代谢完毕，随粪便排除。在该试验研究剂量与条件下，壳聚糖—庆大霉素缀合物无致死性作用和明显毒性作用。

关键词：壳聚糖；庆大霉素缀合物；安全性评价

庆大霉素是从放线菌科单孢子属发酵培养液中提取出的一种氨基糖苷类抗生素，具有良好的水溶性，主要用于治疗革兰氏阴性菌引起的感染，但庆大霉素在使用过程中有诸多毒副作用，例如耳毒性和肾毒性[1]。单一庆大霉素的使用、治疗仍存在许多限制因素，为了避免使用庆大霉素给药时产生的毒副作用，大量功能化抗生素药物被开发研究，优化后的庆大霉素既有较好的抗菌性能且有效避免其毒副作用[2]。壳聚糖是一种结构类似于纤维素的天然高分子化合物，具有高密度正电荷且能被动物机体完全吸收的特点[3]。将壳聚糖和庆大霉素通过氧化和席夫碱反应接枝，利用美拉德反应对壳聚糖上的氨基、羟基进行化学修饰，可显著提高壳聚糖的抗氧化性、抗菌性、溶解性等理化性质[4]。本试验旨在确定CS-GT在小鼠体内的适宜剂量，通过亚急性经口毒性试验和毒代动力学研究，初步揭示药物毒性，为慢性毒性试验和临床试验剂量提供参考，并分析其在体内的吸收、代谢及浓度变化，判断毒性靶器官，为临床不良反应预测提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂材料

壳聚糖接枝庆大霉素缀合物（接枝率：16.76%）由广东海洋大学化学与环境学院李程鹏老师课题组提供；异硫氰酸荧光素FITC购自上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.2 亚急性经口毒性试验

12只100～150 g SPF级SD大鼠随机分为4组（n=3）：对照组、CS-GT低（250 mg/kg）、中（500 mg/kg）、高（1 000 mg/kg）剂量组。禁食12 h后，分别灌胃CS-GT或蒸馏水，连续5 d监测体重、饲料和饮水消耗，并观察一般症状。

1.3 CS-GT在小鼠体内吸收及组织分布试验

48只SPF级小鼠分12组，按4.5 h、6 h、7.5 h采样时间分为3组，每组再分对照组、低（200 mg/kg）、中（400 mg/kg）、高（800 mg/kg）剂量组。禁食12 h后，FITC-CS-GT溶解灌胃。给药后按设定的采样时间眼球取血离心制备血清样品，取肝、脾、肾、胃内容物、肠及肠内容物，匀浆离心制组织样，检测荧光强度。

试验小鼠经口给药后按设定的采样时间分别避光收集粪便，按每100 mg粪加入1 mL PBS，充分匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液制备样品，测定样品中荧光强度变化。

1.4 统计学分析

所有试验结果均来自至少3个独立试验，试验数据用平均值±标准差（±s）表示，通过单因素方差分析和T检验确定统计学意义。试验数据采用IBM SPSS Statistics 27软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 亚急性经口毒性试验

试验期间，各剂量组大鼠生长行为正常，无死亡，各剂量组大鼠的精神状态、食量等无异常，未见嗜睡、烦躁、呕吐、厌食、脱毛及排泄无异常。各组大鼠体重均有不同程度的增长，其中实验组大鼠体重增长显著，高剂量组大鼠增重27.3 g，总进食113.41 g，食物利用率24.1%（图1）。解剖未见明显病理变化。

2.2 CS-GT在小鼠体内的组织分布

小鼠单次经口给药FITC-CS-GT 4.5h后，除血清外，在肝、脾和肾组织有CS-GT分布，在肝中，低中剂量CS-GT在4.5 h～6 h代谢极显著，其他时间段并无显著性差异。在脾中，低剂量和中剂量，在4.5 h～6 h代谢极显著，高剂量在6h～7.5 h代谢显著，在肾组织中CS-GT随时间依赖性减少；由于存在吸收过程，在给药后6 h左右药物吸收达到高峰，之后迅速从血液中向外周分布（图2）。

2.3 CS-GT在小鼠体内的吸收及排泄

由图3可知，小肠内低、中、高剂量CS-GT荧光强度分别在4.5 h、6 h和7.5 h出现显著增加，并随时间增长而上升。在大肠中，低、中剂量CS-GT在4.5 h和6 h与对照组差异显著，7.5 h时极显著增加，而高剂量CS-GT在所有时间段均极显著增加。粪便中，6 h的药物量与其他时间点存在显著差异，4.5 h至6 h药物代谢量增多，代谢增强；6 h至7.5 h药物代谢量减少，呈现下降趋势。

3 讨论

硫酸庆大霉素的腹腔注射半数致死量为294.52 mg/kg[5]，壳聚糖的LD50gt;1 500 mg/kg[6]。在亚急性毒性试验中，根据试验大鼠的体重计算出灌胃量约为2～3 mL。试验组分别选择了250 mg/kg、500 mg/kg以及1 000 mg/kg剂量的药物进行试验。结果显示与正常对照组相比，大鼠各项生理检测指标均无统计学差异。

异硫氰酸荧光素（FITC）是荧光免疫测定中常见的荧光探针，并广泛用于蛋白质的荧光标记，也用于与其他类型的生物材料或生物分子偶联以进行成像的示踪剂[7-8]。Onish[9]等将腹腔注射荧光标记水溶性壳聚糖后，壳聚糖迅速分布于小鼠肾脏和尿液中，无体内积累。本试验结果显示CS-GT在小鼠体内经口服吸收后主要分布在肝、脾、肾，并在这些组织中代谢。肝、肾中CS-GT低中剂量在4.5～6 h代谢差异显著，肾中药物浓度随时间降低，提示组织特异性分布和肾小管重吸收作用，推测CS-GT由肠道吸收后在肾脏和肝脏中代谢。此外，在肠道中不同时间段均出现显著性增加，粪便中药物的浓度在6 h时达到峰值，推测部分CS-GT在肠道中吸收后，剩余部分经肠道随着粪便排泄。

随着新型生物材料应用技术的不断探索，CS-GT作为一种具有较强抑菌性的药物，在生物用药领域存在巨大的研究及应用价值，此试验结果可为进一步药理实验提供参考。

结语

本研究结果表明，在该实验条件下，CS-GT未见亚急性毒性，通过肠道吸收后在8 d后经肝和肾代谢出体外。CS-GT具有较高的食用安全性，壳聚糖接枝有效降低了庆大霉素的毒性，该试验结果可为进一步开发CS-GT成为饲料添加剂提供理论依据。■

参考文献：

[1] KATARY M，SALAHUDDIN A.Ameliorative effect of gossypin against gentamicin-induced nephrotoxicity in rats [J].Life Sciences，2017，176：75-81.

[2] 苏文义，梁凤颜.功能化庆大霉素在抗菌领域中的应用[J].广东化工，2022，49（24）：102-4.

[3] ARDEAN C，DAVIDESCU C M，NEMEŞ N S，et al.Factors Influencing the Antibacterial Activity of Chitosan and Chitosan Modified by Functionalization [J/OL] 2021，22（14）：10.3390/ijms22147449

[4] 梁凤颜.壳聚糖—庆大霉素缀合物对副溶血弧菌感染对虾的治疗作用及机制[D]，2020.

[5] 陆风琴，陆艺，张艳奇，李万仓，娄建石.小诺霉素与庆大霉素在小鼠体内的时间毒性比较[J].中国抗生素杂志，1994，（06）：447-50.

[6] MINAMI S，OH-OKA M，OKAMOTO Y，et al.Chitosan-inducing hemorrhagic pneumonia in dogs [J].Carbohydrate Polymers，1996，29（3）：241-6.

[7] RAVEENDRAN S，POULOSE A C，YOSHIDA Y，et al.Bacterial exopolysaccharide based nanoparticles for sustained drug delivery，cancer chemotherapy and bioimaging [J].Carbohydrate Polymers，2013，91（1）：22-32.

[8] DAS S K，DEY T，KUNDU S C.Fabrication of sericin nanoparticles for controlled gene delivery [J].RSC Advances，2014，4（5）：2137-42.

[9] ONISHI H，MACHIDA Y.Biodegradation and distribution of water-soluble chitosan in mice [J].Biomaterials，1999，20（2）：175-82.

收稿时间：2025-1-10

作者简介：王玉玲（2000—），女，硕士。研究方向：家畜中病毒与霉菌毒素脱毒剂的研发。

通讯作者：雍艳红（1977—），女，博士。研究方向：动物应激性致病机制及防控、海洋加工副产物资源化利用的研究。