基于超高效液相色谱-质谱联用技术和便携式拉曼光谱仪鉴定模拟老化纺织品中的靛蓝染料

关键词 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱；便携式拉曼光谱；靛蓝；纺织品老化

天然纤维的使用由来已久，其中应用最广泛的是取自植物种籽的棉纤维和取自动物分泌物的丝纤维。随着染织技术的进步，采用天然染料染织棉和丝等天然纤维可以获得图案丰富、风格迥异的染织物。靛蓝（Indigo）作为来源最广泛的蓝色系天然植物染料，不仅是人类所知的最古老染料之一，也因其具有优越的染色性能和耐光性能被广泛应用于织物的染色加工。然而，在保存过程中，由于潮湿[1]和光照[2]等因素的影响，纺织品中天然染料容易发生老化褪色现象，给染料的识别鉴定带来困难，也严重影响纺织品文物的保护与修复。

在纺织品文物的分析方法的研究中，对纤维种类[3]、纤维结构[4]和加工技艺的探索方法已经相当成熟。然而，对于其中所用的特定天然染料的识别鉴定仍存在困难，尤其是纺织品中老化染料的识别鉴定。目前，虽然有部分技术，如拉曼光谱[5-6]、光纤反射光谱[7]、原位紫外可见-荧光法[8-9]以及高效液相色谱[10-12]等，已被成功应用于纺织品中天然染料的鉴定，但由于可供分析的文物纺织品样品量极少，对鉴定方法的分离效果、精确度和灵敏度都提出了更高的要求。相对而言，超高效液相色谱-质谱联用技术显示出极大的优势。例如，研究者采用超高效液相色谱-质谱联用技术鉴定纺织品中的茜草、苏木、红花、姜黄和黄檗等天然染料[13-15]，并采用该技术实现了唐代纺织品文物中茜草和紫草染料的识别[16]。此外，非侵入式检测手段也成为研究者关注的对象[17]，其中，便携式拉曼光谱技术为珍贵文物的无损检测和现场检测提供了便利。对于靛蓝染料，虽然已有研究探讨了其在溶液和凝胶介质中的光老化降解产物及机理[1，18-19]，但缺乏对染织品中的靛蓝在光老化和酸老化后的识别检测研究。

为模拟纺织品文物在馆藏和墓葬中的保存环境，本研究对现代纺织品棉和丝进行靛蓝模拟染色，并进行紫外光老化和酸老化处理。采用高效快捷的超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（Ultra-highperformance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight-mass" spectrometry， UPLC-Q-TOF-MS）联用技术以及原位无损的便携式拉曼光谱（Portable Raman spectroscopy， P-RS）技术，对老化前后棉料和丝料中的靛蓝成分进行分析检测。本研究结果为古代纺织品老化后靛蓝染料的检测提供了思路，也为相关文物的保护和修复提供了科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Zeiss Gemini 500 场发射扫描电子显微镜（卡尔蔡司（上海）管理有限公司）；ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪（中国教学仪器设备有限公司）；R785-105-ST 便携式拉曼光谱仪（常州先舟环保科技有限公司）；紫外光老化箱（自制）。

靛蓝标准品（纯度gt;98%，上海麦克林试剂公司）；靛红标准品（纯度gt;98%，上海陶术生物科技有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；NaOH（分析纯，天津科茂化学试剂有限公司）；浓HCl（质量分数36%～38%）和氯仿（分析纯）（国药集团化学试剂有限公司）；保险粉（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）。实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm），由Milli-Q Integral 10 纯水仪（美国密理博公司）制备。未染色棉布（100%棉）及丝绸（100%丝）购于本地市场。

1.2 实验方法

1.2.1 靛蓝染色模拟样品的制备

靛蓝是一种还原性染料，微溶于水，直接上染的染色效果和色牢度较差。参照古代传统染色工艺，将靛蓝加入到2 g/L NaOH 溶液中，再分批加入适量保险粉，搅拌溶解得到靛白隐色盐溶液，其中，所加入NaOH、保险粉与靛蓝的质量比为2∶5∶2。将未染色的棉布和丝绸清洗后平整浸入靛白隐色盐溶液染色，布料整体浸于液面下以保证染色均匀。浸泡45 min 后取出，避光自然氧化晾干，洗去染色棉布和丝绸的浮色，并裁剪成75 mm×25 mm 大小的长条型棉料和丝料样品。

紫外光老化：搭建紫外光老化装置，长36 cm、宽18 cm、高22 cm，样品台与紫外灯的垂直距离为15 cm，选用波长为340 nm 的UVA 灯管（20 W）；参考文献[14]的方法对染色后的棉料和丝料样品进行紫外光加速老化实验，持续照射20 d 后取出，期间每隔12 h 更换样品的位置以保证光照均匀。

酸老化：配制pH=2 的HCl 溶液，将靛蓝染色的棉料和丝料样品分别浸入酸液中，密封浸泡20 d 后取出，用超纯水重复清洗至pH=7，晾干备用。

1.2.2 萃取溶剂和萃取方法的优化

靛蓝在大多数常见溶剂中的溶解度有限，而在DMF 中具有较好的溶解性能，因此采用DMF 作萃取剂或剥色剂提取样品中的靛蓝。然而，靛蓝的同分异构体靛玉红在DMF 中也具有较好的溶解度，这在一定程度上干扰了靛蓝的准确识别。鉴于此，本研究采用两步萃取法萃取靛蓝：（1）采用DMF 从靛蓝染色的棉料和丝料中分别萃取目标化合物，过滤得到滤液后用氮气吹干；（2）加入氯仿对残留物进行复溶处理，采用0.22 μm 的针头式滤器过滤以获取靛蓝的氯仿溶液。将此溶液引入色谱系统进行检测，每类样品重复3～5 次取样分析。

1.2.3 扫描电子显微镜测试

Zeiss Gemini 500 场发射扫描电子显微镜（SEM）分辨率最大可达0.6 nm，加速电压在0.02～30 kV 范围内连续可调。将待测棉料和丝料样品裁剪成1 cm×1 cm 的小块，平整铺排到贴有导电胶带的样品台上，镀金110 s 后进样。使用SE2 探测器，工作距离为8.8 mm，分别在放大倍数为150 倍和1500 倍下观察紫外光老化前后以及酸老化前后的棉料和丝料样品的表面形貌。

1.2.4 UPLC-Q-TOF-MS测试条件

ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm），柱温为25 ℃；流动相A 为0.1%（V/V）甲酸溶液，流动相B 为乙腈，流速为0.15 mL/min，进样量为5 μL。梯度洗脱程序：0～1 min， 90%～80% A；1～6 min， 80%～20% A；6～11 min， 20% A；11～16 min， 20%～90% A；16～18 min， 90% A。

采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式检测。离子源温度为120 ℃，脱溶剂气温度为500 ℃，脱溶剂气流量为800 L/h，毛细管电压为1.5 kV，锥流量为50 L/h；采用MSE 数据采集模式，设置m/z 50～2000 范围内的高性能全扫描检测。采用亮氨酸脑啡肽作为实时校正液。

1.2.5 P-RS测试条件

采用785nm波长的光源，最大功率为650 mW，响应范围为100～1000 cm^–1，适用于现场和非侵入性检测的需求。分别选取少量光老化处理以及酸老化处理前后的棉质和丝质纺织品样品，采用便携式拉曼光谱仪对其进行检测，得到拉曼光谱图。

2 结果与讨论

2.1 不同老化方式对棉料和丝料表面形貌及靛蓝染色的影响

通过宏观观察和SEM 表征紫外光老化前后和酸老化前后靛蓝染色棉料和丝料的表面形貌，结果如图1 和图2 所示。未老化靛蓝染色的棉料（图1A）和丝料（图2A）呈现深蓝色，纤维排列整齐。经过紫外光加速老化后，两者均出现了明显的褪色或变色现象（图1D 和2D），其中，丝纤维（图2D）发生了较大程度的粉化，纤维强度显著降低。与光老化相比，酸老化处理后的两种纤维宏观变化较小（图1G 和2G）。

SEM 结果进一步揭示了纤维微观结构的差异。未老化靛蓝染色的棉纤维（图1B 和1C）为扁平带状，伴有天然卷曲，表面具有不规则凹陷，且不均匀地附着有带状的染料小分子；紫外光老化后（图1E 和1F），棉纤维表面裂纹增多，纤维流失现象加剧；酸老化处理后的棉纤维（图1H 和1I），其表面纤维流失程度相较于光老化样品有所减轻。对于靛蓝染色的丝纤维，可观察到未老化样品（图2B 和2C）纤维排列整齐，表面光滑，截面呈圆滑的三角形或多边形；紫外光老化后，丝纤维不仅表面细小裂纹增多，还出现大量断口（图2E 和2F）；尽管酸老化处理后的丝纤维也呈现出更多的表面裂纹，但其仍然排列相对整齐（图2H 和2I），可见丝纤维的酸老化程度弱于紫外光老化。因此，紫外光老化及酸老化对靛蓝染色的棉料和丝料的表面形貌有不同程度的影响。与酸老化处理结果相比，紫外光老化后，靛蓝染色的棉料和丝料纤维都发生了更显著的变化，纤维变得更加脆弱，强度显著降低。同时，棉纤维比丝纤维表现出更好的耐紫外光老化性能。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS 检测棉料和丝料中的靛蓝染料

2.2.1 UPLC-Q-TOF-MS 检测靛蓝标准品的特征信息

为了确保老化纺织品中靛蓝染料的准确识别检测，首先采用UPLC-Q-TOF-MS 检测靛蓝标准品的特征信号，为老化前后模拟棉料和丝料样品萃取液中的靛蓝成分提供对照。如图3A 所示，靛蓝标准品的总离子流图（TIC）显示出2 个较强信号峰，其中，保留时间为7.24 min 的峰被确认为靛蓝的特征信号峰；在UPLC-Q-TOF-MS 的提取离子流图（EIC）中只在7.24 min 处有单峰，并在正离子模式下成功识别出其对应的靛蓝的准分子离子峰（m/z 263.0830）。在总离子流图中7.24 min 处色谱峰的一级质谱图如图3B 所示，校正后的丰度最大的碎片离子峰对应的质荷比为263.0830，与单同位素精确质量数263.0821 相近，与靛蓝标准品的误差值为3.4×10^–6。因此，推测7.24 min 处的色谱峰为靛蓝的特征信号峰。上述结果为后续样品中靛蓝的定性分析提供了重要依据。

2.2.2 UPLC-Q-TOF-MS 检测紫外光老化和酸老化前后棉料和丝料萃取液中的靛蓝

按照1.2.2 节的方法，对紫外光老化以及酸老化前后的靛蓝染色棉料样品进行萃取处理，并通过UPLC-Q-TOF-MS 检测萃取液中的靛蓝成分，得到的TIC 图如图4A 所示。在靛蓝染色棉料样品的未老化、紫外光老化和酸老化图谱（图4A）中，靛蓝萃取液的TIC 图都显示在7.25 min 附近存在明显的色谱峰，其一级质谱图（图4B～4D）与靛蓝标准品（图3B）一致，均可观察到正离子模式下靛蓝的准分子离子峰（分别为m/z 263.0833、263.0845 和263.0845），按照2.2.1 节所述方法进行误差计算，最终可以判断未老化、光老化和酸老化的3 个棉料样品中7.25 min 附近的色谱峰为靛蓝的色谱峰。

对紫外光老化前后以及酸老化前后的靛蓝染色丝料样品，同样采用1.2.2 节的方法进行萃取，采用UPLC-Q-TOF-MS 仍能检测到萃取液中存在靛蓝成分。如图5A 所示，在未老化、紫外光老化和酸老化丝料样品中，靛蓝萃取液的TIC 图显示在7.24 min 附近同样存在明显的色谱峰，按照2.2.1 节所述方法进行误差计算，其一级质谱结果（图5B～5D）（分别为m/z 263.0832、263.0795 和263.0839）符合靛蓝的准分子离子峰特征，实现了靛蓝成分的检测。除此之外，光老化丝料的萃取液中还检测到靛蓝的光老化产物靛红（m/z 148.0384）。采用与靛蓝一致的UPLC-Q-TOF-MS 测试条件检测靛红标准品，发现在4.45 min 处存在色谱峰（图6A），在正离子模式下成功识别出其对应的靛蓝的准分子离子峰。此峰对应的一级质谱图（图6B）显示，校正后的丰度最大的碎片离子峰对应的质荷比为148.0384，与单同位素精确质量数148.0399 相近，可以判断为靛红。光老化后的棉料萃取液中靛红的信号强度较弱，表明丝料中的靛蓝在紫外光老化条件下更易发生老化反应，导致结构发生变化。

2.3 P-RS 检测老化前后棉料和丝料中的靛蓝

为建立更快速的无损检测方法，采用P-RS 对老化前后棉料和丝料中的靛蓝成分进行分析。对未染色且未老化的棉料和丝料进行785 nm 激发光源下的P-RS 检测，结果如图7 中谱线d 和谱线e 所示，未染色的棉料和丝料样品的拉曼谱图呈现平直的信号，未观察到明显的拉曼峰。对靛蓝标准品、未老化的靛蓝染色棉料和丝料进行P-RS 检测，结果表明，在靛蓝标准品的P-RS 图谱中能够清晰地观察到位于754、670、545 和264 cm^–1 处的特征拉曼峰（图7 谱线a），在未老化的棉料（图7A 谱线b）和丝料（图7A 谱线c）染色样品中也能检测到相似的拉曼信号。

无论是老化后的棉料（图8A）还是丝料（图8B）样品，其拉曼光谱显示出相似的规律。在紫外光老化后的样品中，虽然能够检测到靛蓝的拉曼信号（图8A 和8B，谱线c），但其信号强度相较于未老化样品（图8A 和8B，谱线b）有所减弱，其中丝料的信号强度（图8B 谱线c）降低尤为显著（尤其是545 cm^–1 处的信号峰），这表明丝纤维上的靛蓝相对于棉纤维上的靛蓝更不耐紫外光老化，此结果与图1 和图2 中靛蓝染色纤维实物图像和SEM 图像结果一致。经过酸老化的样品检测结果显示（图8A 和8B，谱线a），相较于未老化样品（图8A 和8B，谱线b），在755、669、545 和258 cm^–1 附近的靛蓝的拉曼信号更突出，这可能与酸老化导致纤维结构变化或染料分子暴露有关。上述结果表明， P-RS 可以作为一种快速的无损检测方法检测老化前后棉料和丝料中的靛蓝成分。

以上分析结果表明， UPLC-Q-TOF-MS 和P-RS 两种检测方法各有优势。P-RS 的优点在于可实现现场快速检测和定性分析，并且对检测样品的破坏程度较小；不足之处在于对真实纺织品文物所处环境要求较高。UPLC-Q-TOF-MS 需要对样品进行前处理，是破坏式分析，但UPLC-Q-TOF-MS 灵敏度高，真实纺织品文物所处环境的复杂程度对其限制较小。因此，在实际应用中，建议将两种分析方法结合使用，以实现多种环境下靛蓝的有效检测。

3 结论

为了更精准模拟古代纺织品文物在实际保存环境下的潜在老化情况，本研究选取古代染织最常用的靛蓝染料对棉料和丝料纺织品进行染色，并通过紫外光照射和HCl 溶液（pH=2）处理，模拟纺织品的老化过程，获得用于识别检测的靛蓝染色模拟老化样品。在此基础上，采用UPLC-Q-TOF-MS 和P-RS 对模拟样品中的靛蓝染料进行检测分析，建立了高效的UPLC-Q-TOF-MS 分离检测方法，即以0.1%甲酸溶液和乙腈为流动相，在18 min 内实现流动相比例的梯度调整。在此条件下，无论是光老化还是酸老化前后的棉料与丝料样品，都能在靛蓝萃取液中检测到位于7.24 min 附近的中等强度的色谱峰。此色谱峰对应的一级质谱图在正离子模式下呈现出与靛蓝标准品相符的准分子离子峰，证明了靛蓝的存在。此外，在光老化后的丝料样品中，还检测到了分子量为148.0359 的物质，证实是靛蓝的光老化产物靛红。同时，P-RS 分析结果显示，在经历紫外光老化和酸老化后，依然可以检测到纺织品中靛蓝的特征信号峰，这为纺织文物样品中靛蓝染料的原位、无损检测提供了有力支撑。值得注意的是，在紫外光老化后的丝料样品中，靛蓝的P-RS特征信号强度明显降低，这表明丝料上的靛蓝相较于棉料在紫外光老化过程中可能发生了更显著的变化。酸老化后，无论是棉料样品还是丝料样品中的靛蓝拉曼信号均表现出增强的趋势。本研究通过模拟纺织品文物的保存环境，结合UPLC-Q-TOF-MS 与P-RS 技术建立了高效且快速的靛蓝染料鉴定方法，其中， P-RS 方法具有快速无损的特点，为纺织品文物中靛蓝染料的原位检测提供了有力支撑，而UPLC-Q-TOF-MS 技术具有高分辨率、低检出限和高灵敏度的特点，为后续的相关定量分析研究提供了可能。

致谢 感谢西安交通大学分析测试中心白璐老师和刘佳老师在液质联用和拉曼分析中的帮助和支持。