基于Plackett-Burman设计和响应面法优化枣花蜂蜜挥发性成分的萃取条件

摘要：为了提高蜂蜜中挥发性成分的顶空固相微萃取（head space-solid phase micro extraction，HS‑SPME）效率，以便利用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatograph-mass spectrometer，GC‑MS）对其进行更精确的定性与定量分析，以枣花（Ziziphus jujuba Mill.）蜂蜜挥发性成分的色谱图总峰面积作为考察指标，采用Plackett-Burman（PB）设计和响应面（response surface methodology，RSM）对枣花蜂蜜的萃取条件（萃取温度、萃取时间、样品量、去离子水添加量、氯化钠添加量和搅拌速度）进行优化。结果发现，萃取温度、萃取时间和样品量对色谱图总峰面积影响显著。优化后的萃取条件为萃取温度68.5 ℃、萃取时间51.6 min、取样量5.1 g，在最优萃取条件下，色谱图总峰面积可达2.20×109 mAU·min-1。以上研究结果为蜂蜜中挥发性成分的进一步定性与定量分析提供一定的方法性指导。

关键词：枣花蜂蜜；挥发性成分；顶空固相微萃取；Plackett-Burman设计；响应面分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0384

中图分类号：S896.1

文献标志码：A

文章编号：1008‑0864（2025）01‑0181‑12

蜂蜜是由蜜蜂（Apis mellifera L.）采集蜜源植物的花蜜或蜜露后，将其储存于巢房中，并经脱水、发酵和成熟等过程形成的一种天然甜味物质[1]。天然蜂蜜中含有多种挥发性物质，其主要由蜜源植物的香气物质和蜜蜂的代谢产物组成。不同种类的蜂蜜挥发性物质组成不同，而且蜂蜜的产地、季节、储存条件、加工方式等因素都会影响挥发性物质的组成和含量[2]。因此，对蜂蜜中挥发性物质进行分析和鉴定可以作为蜂蜜质量评价和鉴别的重要依据[3]。

常见的蜂蜜挥发性成分萃取技术包括固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）、顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HSSPME）、溶剂萃取、超临界流体萃取法（supercritical fluid extraction，SFE）等。SPME是一种基于无溶剂样品预处理的技术，通过注射器内石英纤维表面上的特殊固相涂层，对样品挥发性成分进行萃取和富集[4‑5]。HS‑SPME 结合了顶空技术和SPME技术的优点，通过加热使样品挥发性成分进入气相空间，然后使用SPME纤维吸附和富集挥发性成分，最后将纤维送入气相色谱仪进行分析[6]。研究表明，使用HS‑SPME对蜂蜜中挥发性物质进行提取，再结合气相色谱-质谱联用（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，在蜂蜜中检测到的挥发性物质多达93种，主要为醇类、酮类、醛类、羧酸类、萜烯类、烃类、苯和呋喃衍生物等化合物[7-9]。Neggad等[10]利用HS-SPME结合GC-MS分析7种不同蜜源植物蜂蜜中的挥发性成分发现，各组蜂蜜样品的挥发性成分存在较大差异，可以作为鉴定蜜源植物和蜂蜜产地的特定标志。Igor等[11]利用HS-SPME法和超声波萃取法对马哈利樱桃（Prunus mahaleb L.）蜂蜜中的挥发性成分进行萃取，再结合GC-MS分析发现，香豆素可作为该种蜂蜜的潜在生物标志物。为更准确、高效地萃取蜂蜜中挥发性成分，分析其组成和含量，需对萃取条件进行优化。以往的研究多采用逐因子试验来改变1个因素以比较各因素选定水平的优劣，但这种方法无法提供未考察区域的信息。相比之下，Plackett-Burman（PB）法可以通过较少的试验次数筛选出对试验结果最重要的因素[12]。在PB设计中，每个因素都被分配到2个水平，通常为高水平和低水平，然后在每个试验中选择其中1种水平，通过对试验结果的分析筛选出对蜂蜜挥发性成分含量最具影响的因素[13-15]；然后通过响应面（response surface methodology，RSM）法对筛选出的因素进行优化，通过对响应变量的测定和分析，建立响应变量与试验因素之间的数学模型，利用统计学方法对模型进行分析和求解，从而确定最佳的萃取条件，以获得最高的挥发性成分含量[16-18]。

本研究将PB 法和RSM 法相结合，对枣花蜂蜜挥发性成分的HS‑SPME萃取条件进行优化，以确定蜂蜜样品挥发性成分的HS‑SPME萃取最佳条件，为其挥发性成分进一步高效、准确的分析提供方法性指导。

1 材料与方法

1.1 样本采集与处理

枣花蜂蜜样品于2022年6月采集于甘肃省临泽县养蜂场（39°15′26″N、100°16′44″E）。采样时养蜂场周围的主要开花植物为枣树，且处于盛花期，种植面积约30 hm2。样品采集后密封，在室温下轻摇10 min至均匀状态，备用，其基本理化指标如表1所示。

1.2 仪器与试剂

试验仪器包括电子天平（AR5120，美国Ohaus公司）、气相色谱-质谱联用仪（7890A GC/5975C MS，美国Agilent 公司）、手动固相微萃取装置、50/30 μm 萃取纤维头（DVB/CAR/PDMS，美国Supelco 公司）、加热磁力搅拌器（PC-420D，美国Corning公司）；氯化钠为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 萃取纤维老化

50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取纤维头在首次使用时需在气相色谱图的进样口老化，温度为270 ℃，时间为1 h，直至空载时色谱图无干扰峰出现，之后每使用8～10次需老化1次[19]。

1.4 顶空固相微萃取

准确称取一定质量的蜂蜜样品于15.0 mL顶空瓶中，在预先设定好温度的加热磁力搅拌器上平衡一定的时间，将老化好的固相微萃取针插入样品瓶中大约1 cm处（不要接触到样品，以免污染针头），推出萃取头，在设定温度下顶空吸附预制时间，收进萃取头后，拔出针头，迅速插入气相进样口（萃取头每次插入衬管的长度需保持不变，确保试验的可重复性），250 ℃下解析一定时间。

1.5 GC-MS 分析条件

GC 条件：HP-5MS 毛细管色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升温程序：初始温度40 ℃，保持2.0 min，然后以4 ℃·min-1 的速率升温到160 ℃，保持2.0 min，再以10 ℃·min-1 升温至250 ℃，保持5.0 min；进样口温度250 ℃；载气为高纯度氦气（纯度≥99.999%）；恒流流速1.5 mL·min-1；压力11.962 psi；整个模式采用不分流进样[8， 20‑21]。

MS 条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，四极杆温度150 ℃，溶剂延迟3 min，扫描质荷比（m/z）范围55～500[8， 22]。

1.6 单因素试验设计

1.6.1 萃取温度优化

分别将萃取温度设置为40、50、60、70和80 ℃，固定萃取的样品量为5.0 g、去离子水添加量为0.5 g、氯化钠添加量为0.3 g、搅拌速度为650 r·min-1、萃取时间为50 min，以色谱图总峰面积作为衡量指标，比较不同萃取温度对枣花蜂蜜中挥发性成分萃取效果的影响。

1.6.2 萃取时间优化

分别将萃取时间设置为20、30、40、50 和60 min，固定萃取的样品量为5.0 g、去离子水添加量为0.5 g、氯化钠添加量为0.3 g、搅拌速度为650 r·min-1、萃取温度为60 ℃，以色谱图总峰面积作为衡量指标，比较不同萃取时间对枣花蜂蜜中挥发性成分萃取效果的影响。

1.6.3 样品量优化

分别将萃取样品量设置为2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 g，固定萃取的去离子水添加量为0.5 g、氯化钠添加量为0.3 g、搅拌速度为650 r·min-1、萃取温度为60 ℃ 、萃取时间为50 min，以色谱图总峰面积作为衡量指标，比较不同的样品量对枣花蜂蜜中挥发性成分萃取效果的影响。

1.6.4 去离子水添加量优化

分别将萃取时的去离子水添加量设置为0.0、0.5、1.0、2.5和5.0 g，固定萃取的样品量为5.0 g、氯化钠添加量为0.3 g、搅拌速度为650 r·min-1、萃取温度为60 ℃、萃取时间为50 min，以色谱图总峰面积作为衡量指标，比较不同去离子水添加量对枣花蜂蜜中挥发性成分萃取效果的影响。

1.6.5 氯化钠添加量优化

分别将萃取时的氯化钠添加量设置为0.0、0.3、0.6、0.9和1.2 g，固定萃取的样品量为5.0 g、去离子水添加量为0.5 g、搅拌速度为650 r·min-1、萃取温度为60 ℃、萃取时间为50 min，以色谱图总峰面积作为衡量指标，比较不同的氯化钠添加量对枣花蜂蜜中挥发性成分萃取效果的影响。

1.6.6 搅拌速度优化

分别将萃取时的搅拌速度设置为350、500、650、800和950 r·min-1，固定萃取的样品量为5.0 g、去离子水添加量为0.5 g、氯化钠添加量为0.3 g、萃取温度为60 ℃、萃取时间为50 min，以色谱图总峰面积作为衡量指标，比较不同搅拌速度对枣花蜂蜜中挥发性成分萃取效果的影响。

1.7 Plackett-Burman 试验设计

基于前期单因素试验结果，确定萃取温度（A）、萃取时间（B）、样品量（C）、去离子水添加量（D）、氯化钠添加量（E）和搅拌速度（F）6个因素作为考察因素，以色谱图总峰面积作为衡量指标，每个考察因素取2个水平，即低水平（-1）和高水平（+1），通过Plackett‑Burman试验设计（表2），筛选显著影响蜂蜜中挥发性成分萃取效果的因素。

1.8 Box-Benhnken 响应面设计

以Plackett‑Burman 法筛选得到的显著影响蜂蜜中挥发性成分萃取效果的因素为基础，即萃取温度（A）、萃取时间（B）和样品量（C），应用Box-Benhnken 中心组合试验设计的方法进行响应面分析，试验因素与水平设计如表3所示，以色谱总峰面积作为响应值，优化蜂蜜中挥发性成分萃取参数[23‑24]。

1.9 数据处理

所有试验重复3次。气相色谱-质谱联用仪数据使用软件Qualitative Analysis 10.0（美国Agilent公司）进行积分，统计总峰面积。使用GraphpadPrism 9.0（美国GraphPad 公司）软件制图，利用Minitab 16.0（美国Minitab公司）软件进行Plackett-Burman试验设计及数据分析，利用Design-Expert（美国Stat-Ease公司）软件进行响应面分析，使用SPSS 27.0软件进行数据的整理与分析。

2 结果与分析

2.1 萃取条件对枣花蜂蜜中挥发性成分萃取效果的影响

2.1.1 萃取温度

枣花蜂蜜挥发性成分在不同萃取温度下的萃取效果如图1 所示。萃取温度为40 ℃时，萃取纤维吸附待测组分较少，色谱图总峰面积偏小；萃取温度从40 ℃升至60 ℃的过程中，峰面积总体呈先减小后增大趋势，可能是萃取温度的升高加快了物质的扩散和对流，使气相中组分含量升高[25]；当萃取温度为60 ℃时，顶空瓶环境达到平衡，萃取纤维处于饱和状态，总峰面积达到最大值，且显著大于40、50和70 ℃处理。随着温度继续升高至80 ℃，总峰面积呈减小趋势，可能是沸点低的物质在与沸点高的物质竞争中损失，导致萃取纤维的吸附能力降低，某些挥发性成分脱附[26‑27]。综上所述，60 ℃为最佳萃取温度，因此选择50、60、70 ℃进行萃取温度响应面优化试验。

2.1.2 萃取时间

萃取时间是萃取达到平衡所需的时间，由挥发性成分的分配系数、扩散速率、样品基质、体积、萃取纤维头的膜厚、吸附能力以及涂层的物理化学性质等因素共同决定。枣花蜂蜜挥发性成分在不同萃取时间下的萃取效果如图2所示。当萃取时间为20～50 min时，挥发性成分很容易富集到固定相涂层上，吸附量迅速增加，总峰面积随萃取时间的延长逐渐增大[27]，其中30 min时的总峰面积显著大于20 min时；40 min时的总峰面积与20和30 min时无显著性差异；当萃取时间为50 min时，顶空瓶内环境达到平衡，萃取处于饱和状态，总峰面积达到最大值，显著大于其他萃取时间；当萃取时间为50～60 min时，总峰面积随萃取时间的延长逐渐减小，可能是萃取时间过长，原本被吸附的组分出现解吸附现象，使萃取效果降低[26]。综上，50 min为最佳萃取时间，因此选择40、50、60 min 进行萃取时间响应面优化试验。

2.1.3 样品量

枣花蜂蜜挥发性成分在不同样品量下的萃取效果如图3所示。当样品量为2～5 g时，由于样品量小，顶空体积相对较大，挥发性成分易析出，但因挥发性成分含量较少从而导致总峰面积偏小[28]；样品量从5 g升至6 g，峰面积呈现下降趋势，此过程可能是顶空体积变小，挥发性成分含量增加，使得含量高的挥发性成分吸附较多而其他成分未被吸附[29]；当样品量为5 g时，顶空瓶环境达到平衡，萃取纤维处于饱和状态，总峰面积最大，不同样品量处理组间均存在显著差异。综上所述，5 g为最佳样品量，因此选择4、5、6 g进行样品量响应面优化试验。

2.1.4 去离子水添加量

枣花蜂蜜挥发性成分在不同去离子水添加量下的萃取效果如图4所示。去离子水添加量为0.0～5.0 g时，色谱图总峰面积呈先升高后降低趋势，各处理组间存在显著差异，其中去离子水添加量为0.5 g时，色谱图总峰面积最大。这是由于蜂蜜为粘稠状液体，加入一定量的水，可使粘度下降，有利于挥发性成分的释放[27]；随着去离子水添加量的继续增加，蜂蜜中挥发性成分被稀释，总峰面积随之下降。综上，0.5 g为最佳去离子水添加量，因此选择0.0、0.5、1.0 g进行去离子水添加量响应面优化试验。

2.1.5 氯化钠添加量

萃取过程中盐离子可以增加挥发性风味物质在顶空瓶上空的含量，使其富集在萃取纤维上的量增多[26]。枣花蜂蜜挥发性成分在不同氯化钠添加量下的萃取效果如图5 所示。当氯化钠添加量从0.0～1.2 g时，总峰面积的变化趋势随氯化钠添加量的增加存在一定的起伏，其中当氯化钠添加量为0.3 g时，总峰面积最大，显著高于除添加量为0.0 g外的其他处理。这可能是氯化钠的过量添加影响了基质黏度，从而降低了挥发性成分的扩散速度，产生盐析负效应，使萃取纤维上富集的物质减少[30]。综上所述，0.3g为最佳氯化钠添加量，因此选择0.0、0.3、0.6 g进行氯化钠添加量响应面优化试验。

2.1.6 搅拌速度

枣花蜂蜜挥发性成分在不同搅拌速度下的萃取效果如图6 所示。搅拌速度从350 r·min-1 升至650 r·min-1 的过程中，峰面积总体呈现升高的趋势，500 和650 r·min-1 条件下的总峰面积显著大于350 r·min-1 处理，但500 与650 r·min-1处理间差异不显著。这可能是由于蜂蜜样品的粘度较大，搅拌可促进体系的均匀化，有利于挥发性成分的释放，从而提高对挥发物的检测效率[31]。随着搅拌速度升至950 r·min-1，总峰面积呈先减小后上升的趋势，且950 r·min-1时的总峰面积与500 和650 r·min-1 处理间差异不显著，但950 r·min-1易造成HS-SPME装置的稳定性变差，所以650 r·min-1为最佳搅拌速度。因此，选择650 r·min-1为响应面优化试验的中点。

2.2 关键影响因素的确定

以单因素试验结果为基础，确定Plackett‑Burman试验的因素和水平。由于峰个数和主要挥发性成分峰面积的变化与总峰面积的变化基本保持一致，只是在个别物质略有差异，因此以总峰面积为判定指标即响应值（Y）来分析蜂蜜中挥发性成分的萃取效果，从而筛选得到对其影响显著的因素。由表4和表5可知，萃取温度、萃取时间和样品量对总峰面积影响显著；样品、去离子水、氯化钠的添加量及搅拌速度对总峰面积无显著影响。因此，选用萃取温度、萃取时间和样品量作为响应面分析的影响因素。

2.3 Box-Behnken 响应面分析

响应面分析方案及结果如表6所示。试验共有15个试验点，其中试验号1～12为析因试验，13～15为中心试验，重复3次，用以估计试验误差。

2.3.1 模型建立及显著性检验

利用DesignExpert软件，对表6的数据进行二次多项式回归拟合，以色谱总峰面积（Y）为响应值，得到二次多元回归方程如下。

Y=2.151×109+1.882×108A+3.725×107B+4.892×107C+8.547×107AB+2.106×107AC-1.437×108BC-1.201×108A2-3.059×108B2-2.524×108C2 （1）

对模型进行方差分析，结果（表7）表明，一次项A 为极显著，B 和C 均不显著；交互项均不显著；平方项B2极显著，C2显著，A2不显著；模型F=6.54，P=0.026，表明模型是显著的；模型的相关系数为0.921 7，说明自变量与因变量之间的回归关系显著，有助于降低试验误差。因而拟合度良好，试验误差小，可以用于SPME 萃取条件优化的理论预测。

2.3.2 因素间交互作用的影响

根据回归分析结果，各因素间交互作用对总峰面积的影响作如图7～9所示。3组交互作用的响应面坡度都相对平缓，表明其可以忍受处理条件的变异，而不影响响应值的大小。等高线图表示在同一椭圆型区域内，总峰面积相同；在椭圆形的区域中心，总峰面积最大，由中心扩散至边缘则总峰面积逐渐变小[32]。同时等高线的形状可反映交互效应的强弱，椭圆形表示两因素间交互作用显著，而圆形则不显著[33]。由图7可知，样品量为5 g时，随着萃取温度的升高，总峰面积缓慢增加；随着萃取时间的延长，总峰面积呈先增加后有所减少的趋势，表明两者的交互作用不显著。由图8可知，萃取时间为50 min时，随着萃取温度的升高，总峰面积缓慢增加；随着样品量的增加，总峰面积呈先增加后有所减少的趋势，表明两者的交互作用不显著。由图9可知，萃取温度为60 ℃时，随着萃取时间的延长，总峰面积呈迅速增加后略有减少的趋势；随着样品量的增加，总峰面积呈迅速增加后略有减少的趋势。在较长萃取时间与较低样品量区域和在较高样品量与较短萃取时间区域，总峰面积较高，且由响应曲面投影的等高线图为椭圆，表明萃取时间与样品量间的交互作用较显著，与表7的结果一致。

2.3.3 萃取条件的优化及模型验证

通过Expert-design软件预测出基于HS‑SPME的蜂蜜挥发性成分萃取条件优化后为：萃取温度68.49 ℃，萃取时间51.59 min，样品量5.09 g，在此条件下响应面模型预测的总峰面积为2.24×109 mAU·min−1。

为了验证方法的可靠性与重现性，采用优化后的萃取条件进行挥发性成分的HS-SPME验证试验。考虑到试验操作的实际条件，将萃取的最优条件修正为：萃取温度68.5 ℃、萃取时间51.6 min、样品量5.1 g。在此条件下进行4次试验，得到总峰面积为2.20×109 mAU·min−1，与模型预测值之间的相对误差较小（1.13%～1.84%），说明该模型可较好地用于优化蜂蜜挥发性成分固相微萃取的萃取条件。

3 讨论

挥发性成分是蜂蜜中的重要组成部分，对于蜂蜜的香气、口感和品质有着重要影响。通过对蜂蜜中挥发性物质萃取条件的优化可以更深入了解蜂蜜的化学成分和特性，有助于蜂蜜的质量控制和产品开发。

本研究以枣花蜂蜜为试验材料，以气相色谱峰中的总峰面积、峰个数和主要挥发物质峰面积为观察指标，通过Plackett-Burman设计，筛选出显著影响枣花蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取的3个因素，分别为萃取温度、萃取时间和样品量，这一结果为后续的研究提供了重要参考，有助于减少试验次数并提高研究效率。其中，萃取温度的高低影响挥发性成分的释放和溶解；而萃取时间的长短则关系到萃取效率和成分的稳定性；样品量的选择也是关键，它直接影响萃取液的浓度和成分的溶解度。本研究利用响应面法进一步确定最优萃取条件为萃取温度68.5 ℃ 、萃取时间51.6 min、样品量5.1 g。在此最佳条件下，总峰面积可达2 204 894 036 mAU·min−1。经试验验证后，预测结果与验证结果较吻合，说明回归方程可以较好地应用于蜂蜜挥发性成分HS-SPME萃取效率的预测。筛选出的最优萃取温度与蔡秋萍等[8]的研究结果相符合，既能充分地体现蜂蜜挥发性物质的种类，又能不产生新的物质。此外，本研究还探讨了不同因素之间交互作用对萃取效果的影响，发现萃取时间与样品量间存在显著的交互作用，这一结果有助于深入理解萃取机制，为蜂蜜中挥发性成分进一步GC-MS的定性与定量分析提供一定的方法性指导。

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基金项目：国家蜜蜂产业技术体系项目（NYCYTI-43-KXJ17）。